[發(fā)明專(zhuān)利]小分子量透明質(zhì)酸的制備方法與應(yīng)用及透明質(zhì)酸裂解酶基因載體和工程菌

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510734368.5
• 申請(qǐng)日: 2015-11-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105274127A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉浩;張海洋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C12N9/88;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 天津諾德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 12213
• 代理人: 欒志超

1.透明質(zhì)酸裂解酶基因載體，其特征在于：所述基因載體將長(zhǎng)度為2208bp的hylb基因插入載體pET28a中，形成載體pET28a::hylb。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸裂解酶基因載體，其特征在于：所述hylb基因來(lái)源于獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920基因組；

所述hylb基因始于第128個(gè)氨基酸GCC，結(jié)束于終止密碼子TAG，所述hylb基因序列如序列1所示。

3.利用權(quán)利要求1或2所述的透明質(zhì)酸裂解酶基因載體制備得到的透明質(zhì)酸裂解酶工程菌，其特征在于：將透明質(zhì)酸裂解酶基因載體pET28a::hylb轉(zhuǎn)入宿主菌，即獲得透明質(zhì)酸裂解酶工程菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸裂解酶工程菌，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)；所述誘導(dǎo)條件為在20-37℃的條件下，向培養(yǎng)基中加入0-1mMIPTG誘導(dǎo)過(guò)夜；優(yōu)選在20℃的條件下，向培養(yǎng)基中加入0.1mMIPTG誘導(dǎo)過(guò)夜。

5.利用權(quán)利要求3所述的透明質(zhì)酸裂解酶工程菌發(fā)酵制備透明質(zhì)酸裂解酶的方法，其特征在于：按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，將所述透明質(zhì)酸裂解酶工程菌接種到LB培養(yǎng)基上，在37℃的條件下培養(yǎng)，得到菌液；

步驟2，將上述菌液轉(zhuǎn)入離心杯中，4℃離心，收集菌體；

步驟3，將菌體置于預(yù)冷的PBS緩沖液中重懸，得到重懸后的菌體；

步驟4，用超聲破碎儀破碎重懸后的菌體，得到破碎后的菌液；

步驟5，將上述破碎后的菌液，在4℃的條件下離心后，收集上清液，即得透明質(zhì)酸裂解酶粗酶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的透明質(zhì)酸裂解酶的制備方法，其特征在于：在所述步驟3中，所述PBS緩沖液的體積比為5:1～10:1。

7.利用權(quán)利要求5所述的透明質(zhì)酸裂解酶制備小分子量透明質(zhì)酸的方法，其特征在于：按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，底物配制：將野生型獸疫鏈球菌發(fā)酵后所得的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)處理提取得到大分子量的透明質(zhì)酸，將干燥后的大分子量透明質(zhì)酸用超純水溶解，并控制濃度在2～3mg/ml,使其完全溶解，得到底物；

步驟2，酶解：將上述底物在37℃保溫，并加入適量的透明質(zhì)酸裂解酶，并反應(yīng)一段時(shí)間后，即得降解后的透明質(zhì)酸溶液；

步驟3，滅活：將上述降解后的透明質(zhì)酸溶液用沸水煮沸1～2min，得到經(jīng)過(guò)滅活的透明質(zhì)酸溶液；

步驟4，過(guò)濾：將上述經(jīng)過(guò)滅活的透明質(zhì)酸溶液用0.45um濾膜過(guò)濾，除去雜質(zhì)，得到經(jīng)純化的透明質(zhì)酸溶液；

步驟5，沉淀：向上述經(jīng)純化的透明質(zhì)酸溶液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，即得到小分子量透明質(zhì)酸沉淀；

步驟6，冷凍干燥：將上述沉淀在-80℃條件下冷凍干燥，得到小分子量透明質(zhì)酸成品。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：在所述步驟2中，所述透明質(zhì)酸裂解酶的加入量為每1L底物加入46U～79U酶活力單位的透明質(zhì)酸裂解酶。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：在所述步驟2中，所述酶解反應(yīng)時(shí)間為0～6h。

10.利用權(quán)利要求7至9任一所述的小分子量透明質(zhì)酸的制備方法制備得到的小分子量透明質(zhì)酸在食品、化妝品或者醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。