[發明專利]檢測轉基因玉米T4-1-1外源基因純合/雜合狀態的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510728614.6
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105274229A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 張維;周正富;余桂容;郭翠;徐利遠;林敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域：

本發明涉及一種對轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的檢測方法，本發明還涉及針對上述檢測所用的試劑盒。

背景技術

轉基因作物的檢測中，不僅需要知道樣品中是否含有轉基因成分，含有何種轉基因成分，有時還需要確認外源DNA插入的純合或雜合狀態。這種轉基因成分的定性檢測亦稱為篩選檢測。

轉基因成分檢測中，可以將外源DNA看作一個基因座位。純合體的2倍體基因組中檢測靶標核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數為2；雜合體的2倍體基因組中外源DNA插入特征序列的拷貝數為1；非轉基因材料中則為0。因此，轉基因檢測過程中，必需對原材料中靶標核酸序列的遺傳特性進行確認，即確認外源DNA插入所產生的特征序列是純合還是雜合狀態。此外，在轉基因作物遺傳育種過程中，往往需要將轉基因材料與其它材料進行雜交、轉育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學手段快速、簡便鑒定純合體/雜合體育種材料，也有利于縮短育種進程。

迄今未止，國內外還沒有針對轉基因玉米T4-1-1外源基因純合/雜合狀態的檢測方法，只能確定轉基因玉米T4-1-1樣品中是否含有轉基因成分或含有何種轉基因成分。

因此，找到能直接鑒別玉米T4-1-1樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態的方法并開發相應的檢測試劑，很有必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種針對轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的檢測方法，并開發針對上述檢測所用的試劑盒。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明首先設計了一種用于檢測轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的PCR檢測引物。根據轉基因玉米T4-1-1外源插入片段旁側序列信息，在玉米染色體部分設計出一對能夠準確檢測轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的PCR檢測引物，其核苷酸序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。

本發明提供了一種針對轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的檢測方法，其步驟為：

(1)提取待檢測水稻樣品的DNA；

(2)以上述提取的DNA為模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列為擴增引物，建立PCR擴增體系，并進行PCR擴增；

如果僅擴增出一條SEQIDNo.3所示核苷酸序列的片段，鑒定為純合轉基因玉米T4-1-1；

如果擴增出分別為SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列的兩條片段，鑒定為雜合轉基因玉米T4-1-1；

如果僅擴增出一條SEQIDNo.4所示核苷酸序列的片段，鑒定為不是轉基因玉米T4-1-1。

其中，所述的從待檢測玉米樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或經驗證適用于植物DNA提取的試劑盒等各種方法。

本發明中所述的PCR擴增體系可參考以下方法建立：反應體系的總體積為25.0μL，其中，10×LATaqBufferII(Mg²⁺Plus)緩沖液2.5μL，TaKaRaLATaq(5U/μl)聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/LSEQIDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25ng/μLDNA模板2μL，余量為雙蒸水。

所述的PCR擴增條件優選為：94℃變性1min；(94℃20s，65℃5min)30個循環；72℃延伸5min。

本發明還提供了一種用于轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態的PCR檢測試劑盒，其特征是包括有一對PCR檢測引物，所述引物的核苷酸序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。

本發明檢測方法能夠準確的檢測出轉基因玉米T4-1-1外源基因插入的純合/雜合狀態，為轉基因玉米T4-1-1成分檢測標準物質研制、轉基因定量檢測、樣品鑒定奠定了基礎。

附圖說明

圖1PCR方法鑒定轉基因玉米T4-1-1純合體瓊脂糖凝膠電泳圖；其中

M：Trans2KplusIIDNAMarker；1：空白對照；2：T4-1-1純合體；3：T4-1-1受體和T4-1-1純合體混合樣品；4：陰性對照。

具體實施方式