[發(fā)明專利]大腸桿菌噬菌體M13內標質控品的制備、應用和試劑盒

有效

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• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105219737A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發(fā)明（設計）人: 崔紅;李哲群;商興芳;吳秋保;曾家琨
• 申請（專利權）人: 廣州呼研所生物技術有限公司;廣東和信健康科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/92
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

技術領域

本發(fā)明涉及病原體診斷技術領域，具體涉及一種大腸桿菌噬菌體M13內標質控品的制備、應用和試劑盒。

背景技術

隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，以聚合酶鏈式反應為基礎的各種分子生物學診斷技術，因其具有特異性強，靈敏度高，重復性好，定量準確，方便快捷等優(yōu)點，稱為生物醫(yī)學領域內最有價值的研究手段，已經廣泛應用于臨床標本的檢測。在DNA病毒PCR檢測中，影響實驗過程的因素較多，如實驗人員測定操作中的隨機誤差、擴增儀孔間溫度的差異、標本核酸提取后抑制物的殘留、待擴增靶核酸的濃度及試劑問題等，這些因素均可能會影響PCR擴增的效率，進而造成結果的偏差。因此，在做核酸擴增實驗時，需要有嚴格的質量控制措施，即需要有特定的質控物。質控物須具備以下特點：(1)易制備；(2)在貯存和使用過程中穩(wěn)定性好；(3)無生物傳染性；(4)能監(jiān)控整個檢測過程，結果可靠。

傳統(tǒng)的DNA病毒檢測的內標有三種：樣本中看家基因片段(以β-actin為例)，以及質粒DNA，假病毒，但這些質控品都有各自的弊端。樣本中β-actin，若取樣不成功直接影響其結果的判斷，雖然看家基因與目的基因為非競爭性擴增，但如果在樣本中目的基因與β-actin的濃度相差10倍以上，直接干擾和影響目的檢測片段的判斷；質粒DNA雖然穩(wěn)定性好，但質粒易污染實驗室。所以也不宜作為質控品對DNA進行監(jiān)控；假病毒較之前面兩種，是比較理想的選擇，但是其要求一定的技術支持，操作繁瑣。嚴格的內標則是在反應管加入含量一定含量的內標模板，通過內標含量的變化來監(jiān)控整個PCR過程。

大腸桿菌噬菌體M13是包膜蛋白包裹結構的DNA結構，與DNA病毒相似，且M13無致病性，可快速培養(yǎng)。將大腸桿菌噬菌體M13作為DNA的PCR檢測的內標質控品的研究具有重要意義。

發(fā)明內容

基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種大腸桿菌噬菌體M13內標質控品的制備方法。

具體技術方案如下：

一種大腸桿菌噬菌體M13內標質控品的制備方法，包括以下步驟：

(1)宿主菌的制備：挑大腸桿菌ER2738菌種接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；再挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，得到含宿主菌的培養(yǎng)液；

(2)噬菌體M13單克隆的制備：挑噬菌體M13用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)18-24小時，再挑取單個噬菌斑至含宿主菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，得到含噬菌體M13的培養(yǎng)液；

(3)噬菌體M13的擴大培養(yǎng)：將步驟(1)制備的含宿主菌的培養(yǎng)液接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-5小時，得到細菌培養(yǎng)液，再將步驟(2)制備的含噬菌體M13的培養(yǎng)液接種到細菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)液離心，收集上清液，過濾即得到純化的噬菌體M13懸液；

(4)噬菌體M13的分析檢測：取步驟(3)制備的噬菌體M13用熒光PCR法檢測Ct值，并用雙層瓊脂法測效價；

(5)噬菌體M13內標質控品的制備：用凍干稀釋液將噬菌體M13懸液稀釋至Ct值為18-20，分裝于離心管中，真空冷凍干燥，所得凍干品冷凍保存。

在其中一個實施例中，步驟(4)所述熒光PCR法檢測Ct值針對噬菌體M13的擴增引物為SEQIDNO:4和SEQIDNO:5。

在其中一個實施例中，步驟(4)所述熒光PCR法檢測Ct值針對噬菌體M13的探針為SEQIDNO:6。

在其中一個實施例中，步驟(5)所述凍干稀釋液為含有質量分數為0.8-1.2％的牛血清白蛋白和體積分數為45-55％的吐溫20的水溶液。

在其中一個實施例中，步驟(5)所述真空冷凍干燥的溫度為-50℃，壓力為0.2mTorr，所述冷凍保存的溫度為-20℃。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種大腸桿菌噬菌體M13內標質控品。

具體技術方案如下：

一種大腸桿菌噬菌體M13內標質控品，由本發(fā)明上述制備方法制備而成。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述大腸桿菌噬菌體M13內標質控品的應用。

具體技術方案如下:

上述大腸桿菌噬菌體M13內標質控品在DNA病原體的熒光PCR檢測過程中作為內標質控品的應用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種DNA病原體熒光PCR檢測試劑盒。

具體技術方案如下：

一種DNA病原體熒光PCR檢測試劑盒，包含檢測試劑和內標質控品，所述內標質控品為上述大腸桿菌噬菌體M13內標質控品。