[發明專利]基于化學修飾和同位素標記多肽氨基酸序列從頭測序方法

有效

• 申請號: 201510726791.0
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN106645437B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 張麗華;單亦初;張珅;陳玲凡;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種基于化學修飾改性和同位素標記的多肽氨基酸序列從頭測序方法。利用N端和C端標記后的多肽分子質量以及保留時間的相關性，將不同標記的相同多肽的二級質譜圖進行關聯。利用不同標記樣品中多肽在質譜碎裂過程中形成的N端和C端碎片離子對，對多肽氨基酸序列進行從頭測序。本發明通過對多肽使用帶有正電荷的試劑進行修飾改性，有利于多肽在質譜中碎裂時形成豐富的碎片離子；同時，通過使用含有不同輕重同位素的試劑進行標記，多肽在質譜中碎裂時形成成對存在的碎片離子，易于分辨，從而降低干擾信號的影響，提高碎片離子選擇特異性以及從頭測序的速度；利用N端和C端碎片離子的互補性，提高多肽測序準確度和效率。

技術領域

本發明涉及化學修飾改性和同位素標記輔助的蛋白質氨基酸序列從頭測序方法，具體地說是一種通過對多肽的N端和C端分別進行穩定同位素標記以鑒別碎片離子的蛋白質氨基酸序列從頭測序方法。

背景技術

蛋白質是重要的生物大分子，在生命活動中發揮著重要作用。對蛋白質進行測序對于蛋白質一級結構的分析至關重要。盡管目前有些物種存在蛋白質數據庫，可以用搜庫的方法對蛋白質氨基酸序列進行分析。但是，大多數物種仍然沒有可供檢索的蛋白質數據庫，并且對于已經存在數據庫的物種，由于基因變異也會導致其蛋白質氨基酸序列發生變化。因此，非常有必要發展不依賴于數據庫的蛋白質氨基酸序列從頭測序方法。文獻報道中對蛋白質氨基酸序列進行從頭測序的方法主要有以下幾種：(1)通過對多肽的N端，使用帶有酸性基團的試劑進行衍生，然后使用MALDI質譜進行分析，使得多肽碎片片段基本不含有a、b離子，主要以y離子形式存在，從而可以對y離子進行鑒別，實現對多肽的從頭測序；(2)通過對多肽的N端，使用帶有堿性基團的試劑進行衍生，然后使用MALDI質譜進行分析，使得多肽碎片片段基本不含有y離子，主要以a或者b離子形式存在，從而可以對其進行鑒別，實現對多肽的從頭測序。

多肽穩定同位素標記方法是蛋白質組學中一種常用的定量方法，通過對不同樣品多肽的N端和/或者C端分別進行輕、重穩定同位素標記，在隨后的質譜分析中通過比較多肽母離子的信號強度或者碎片離子的信號強度實現不同樣品中多肽和蛋白質的定量(Koehler CJ，Arntzen MO，Treumann A，Thiede B，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)。目前的蛋白質氨基酸序列從頭測序方法，主要通過對一個樣品的多肽一端或者兩端進行衍生，使多肽在碎裂時主要產生一個系列的碎片離子，從而簡化離子碎片種類，進行從頭測序。但是，由于多肽的碎裂機理比較復雜，即使對多肽進行前述處理，多肽在碎裂時仍然會產生其它碎片離子，因此特異性不高，影響從頭測序的準確性；此外，隨著氨基酸序列長度的增加，較大的碎片離子其產生的幾率和強度都會降低，不利于從頭測序。為此，我們通過將同一個樣品分成兩份；將第一份樣品進一步分成兩份，分別對其中的多肽N端進行穩定同位素標記，通過在質譜分析時形成的成對碎片離子，準確辨別b離子；將第二份樣品也分成兩份，通過對多肽的C端進行輕重同位素標記，根據質譜分析時形成的成對離子，準確辨別多肽y離子；利用b離子和y離子的互補性，實現對多肽的準確從頭測序。

發明內容

蛋白質氨基酸序列從頭測序比較困難，由于多肽碎裂機理復雜，造成質譜圖的復雜性和難以準確分辨碎片離子。同位素標記被廣泛應用于蛋白質定量，通過對不同樣品進行不同同位素標記，混合后樣品在一級譜或者二級譜存在質量差異，從而可以被分辨，并利用一級譜或者二級譜的峰面積或者強度進行定量。本發明的目的是利用對多肽兩端分別進行同位素標記，實現對多肽b和y系列碎片離子的鑒別，利用兩者的互補性，提高從頭測序的準確度和速度。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：