[發明專利]基于化學修飾和同位素標記多肽氨基酸序列從頭測序方法

有效

• 申請號: 201510726791.0
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN106645437B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 張麗華;單亦初;張珅;陳玲凡;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.基于化學修飾和同位素標記多肽氨基酸序列從頭測序方法，其特征在于：

將待測多肽樣品分成兩份；

對第一份樣品，使用化學標記的方法對多肽N端的α-氨基進行標記；在進行標記時，將第一份樣品分成等量的兩份，分別使用含有不同同位素的帶有正電荷的輕標記試劑、重標記試劑進行標記，使其中一份樣品中的多肽N端采用輕標記試劑進行標記，使另一份樣品中的多肽N端采用重標記試劑進行標記，且使得二份樣品間輕重標記的相同肽段的分子量相差在0到8Da之間，且不為0；將標記后的二份樣品混合，使用液相色譜-質譜聯用進行分離和鑒定；在質譜鑒定時，將分離窗口設置為2-8 Da，使得不同標記的多肽同時碎裂；根據同位素標記引起的多肽碎片離子質量差異鑒別N端b離子；

對第二份樣品，使用化學標記的方法對多肽C端的羧基進行標記；在進行標記時，將第二份樣品分成等量的兩份，分別使用含有不同同位素的帶有正電荷的輕標記試劑、重標記試劑進行標記，使其中一份樣品中的多肽C端采用輕標記試劑進行標記，使另一份樣品中的多肽C端采用重標記試劑進行標記，且使得二份樣品間輕重標記的相同肽段的分子量相差在在0至8Da之間，且不為0；將標記后的二份樣品混合，使用一維或者二維液相色譜-質譜聯用進行分離和鑒定；在質譜鑒定時，將分離窗口設置為2-8 Da，使得不同標記的多肽同時碎裂；根據同位素標記引起的多肽碎片離子質量差異鑒別C端y離子；

對多肽N端和C端分別進行標記時，使用分子質量和疏水性類似的標記試劑；利用N端和C端標記后的多肽分子質量以及保留時間的相關性找出N端和C端分別被標記的相同多肽的二級質譜圖；結合鑒定到的多肽b離子和y離子，分別對待測多肽樣品中的每一肽段進行多肽氨基酸序列從頭測序分析。

2.按照權利要求1所述的從頭測序方法，其特征在于：所述待測多肽樣品，包括：蛋白質酶解肽段或內源性肽段中的一種或二種以上。

3.按照權利要求1所述的從頭測序方法，其特征在于：

對多肽的N端進行化學標記；化學標記法包括H(CH₂)_nCHO（n=0-8），H(CH₂)_nCOOH（n=0-8），H(CH₂)_nCOCl（n=0-8）中的一種；不同同位素是指輕標記試劑、重標記試劑中分別含有不同輕重同位素¹²C及¹³C、¹⁴N及¹⁵N，或H及氘中的一種或二種以上。

4.按照權利要求1所述的從頭測序方法，其特征在于：

對多肽的C端進行化學標記；化學標記法包括H(CH₂)_nCH₂OH（n=0-8），H(CH₂)_nNH₂（n=0-8）中的一種；不同同位素是指輕標記試劑、重標記試劑中分別含有不同輕重同位素¹²C及¹³C、¹⁴N及¹⁵N，或H及氘中的一種或二種以上。

5.按照權利要求1所述的從頭測序方法，其特征在于：對標記后的肽段，使用電噴霧質譜進行檢測；為了使不同標記的多肽能夠同時碎裂，將二級碎裂窗口設為2-8Da，即母離子質荷比左右各1-4Da的母離子被同時碎裂；

為了實現多肽碎片b離子的分辨，將樣品分成兩份，一份樣品用含有輕同位素的標記試劑對其N端進行標記；對于另一份樣品，則使用含有重同位素的標記試劑對其N端進行標記；

為了實現多肽碎片y離子的分辨，將樣品分成兩份，一份樣品使用含有輕同位素的標記試劑對其C端羧基進行標記；對于另一份樣品，使用含有重同位素的標記試劑對其C端羧基進行標記。