[發明專利]固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法

在審

• 申請號: 201510726461.1
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105154429A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 荊濤;邵詠博;田景芝;鄭永杰;李艷云;李文斌
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 王艷萍

技術領域

本發明涉及到一種固定化脂肪酶的載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法。

背景技術

現代生物技術在化學領域得到了廣泛應用，其中的酶催化反應高效，專一，但是也有一定的缺點，比如游離的脂肪酶做為催化劑使用時存在操作穩定性差、熱穩定性差、容易受到有機溶劑影響而變性失活、難于分離回收再利用等缺點。這一缺點可以通過將酶固定于載體來克服，這樣不僅可以保留酶原有的活性及高度選擇性，而且還會提高酶處理效率、延長酶的使用壽命和降低處理成本，因此制備優良的固定化酶載體是當今社會的研究熱點。其中利用磁性載體固定脂肪酶的技術也較多，如在2011年8月第8期的高分子學報的文章《單分散磁性納米粒子固定化豬胰脂肪酶的研究》公開了一種固定化豬胰脂肪酶的方法，該方法是先用溶熱法制備了Fe₃O₄磁性納米粒子，再用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷對Fe₃O₄磁性納米粒子進行表面改性，然后用戊二醛偶聯法制得了固定化豬胰脂肪酶。該方法使用單一的磁球作為載體，負載的酶量少；而使用戊二醛作為交聯劑，戊二醛的濃度要嚴格控制，濃度過大會使酶的構象發生改變，從而導致酶變性失活。

發明內容

本發明是要解決現有的利用磁性載體固定脂肪酶的方法的酶固定量低、容易導致酶變性的技術問題，而提供固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法。

本發明的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體的制備方法按以下步驟進行：

一、采用溶劑熱法制備Fe₃O₄納米粒子；

二、采用stober法在Fe₃O₄納米粒子外面包裹一層介孔硅，得到具有核殼結構的磁性介孔硅，記為Fe₃O₄MCM-41；

三、采用hummers法制備氧化石墨；

四、按Fe₃O₄MCM-41的質量與氧化石墨的質量比為1：(100～150)的比例稱取步驟二制備的Fe₃O₄MCM-41、量取步驟三制備的氧化石墨分散液，先把Fe₃O₄MCM-41分散到無水乙醇中，再加入氧化石墨分散液，混合液攪拌1～2h，然后滴加3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)，升溫至120～130℃，攪拌回流10～12h，最后用無水乙醇洗滌干凈，冷凍干燥，得到固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體，記為CPS/GO-Fe₃O₄MCM-41。

利用上述的磁性氧化石墨復合物載體固定脂肪酶的方法，按以下步驟進行：

一、稱取固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體CPS/GO-Fe₃O₄MCM-41、pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、脂肪酶，其中CPS/GO-Fe₃O₄MCM-41的質量與pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液的體積的比為1g：(30～50)ml；CPS/GO-Fe₃O₄MCM-41與脂肪酶的質量比為10：(0.36～1)；

二、將pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液分成兩份，向一份中加入CPS/GO-Fe₃O₄MCM-41，攪拌1～12h，得到載體溶液；向另一份中加入脂肪酶振蕩直至完全溶解，得到酶溶液；將酶溶液加入到載體溶液中，放在恒溫振蕩器中在25～50℃、150rpm的條件下恒溫振蕩2～12h，然后用磁分離進行收集，將收集到的固相物用PBS緩沖液洗滌干凈，冷凍干燥，得到磁性氧化石墨復合物固定化脂肪酶。

本發明提供了一種操作簡便、環保具有工業化前景的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法，磁性氧化石墨復合物載體以氧化石墨為“襯底”，通過共價結合的方式接枝磁性介孔硅，采用氯硅烷偶聯劑(3-氯丙基三乙氧基硅烷)共價固定在氧化石墨表面。脂肪酶可以通過共價結合的方式固定在載體上。