[發明專利]一種肉食螨變應原

在審

• 申請號: 201510725111.3
• 申請日: 2015-11-02
• 公開（公告）號: CN106632631A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 郝廷;鄭美林;劉騰飛;王玉玲;鮑亞麗;馬博晨;周俊雄
• 申請（專利權）人: 北京新華聯協和藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術藥物領域，具體涉及一種肉食螨變應原制備方法。

背景技術

過敏性疾病是當代社會中最常見的一種疾病，它是由廣泛存在的過敏原引起的。據世界變態反應組織報告，全世界有30％～40％普通人被過敏問題困擾。世界衛生組織估計，全球約有3億人患有哮喘，其中50％以上的成人和至少80％的兒童患者均由過敏因素誘發，每年約25萬人死于哮喘。世界衛生組織已將變態反應性疾病列為21世紀重點防治的三大疾病之一。

近年來，過敏性疾病的發病率逐年在增加。伴隨著過敏人群的增加，引起過敏的種類多種多樣。螨是全球范圍內最主要的過敏原，現在市售的螨變應原產品主要是戶塵螨和粉塵螨相關的診斷、治療等變應原產品。肉食螨以粉螨為食，在戶塵螨、粉塵螨、粗腳粉螨、腐食酪螨等粉螨生長密集的地方往往能發現大量的肉食螨滋生。因此當肉食螨過敏的病人接觸到肉食螨的排泄物、皮屑、被肉食螨染污的食物等，會引起過敏。由于缺少肉食螨變應原無法進行對肉食螨過敏病人的診斷和治療。未見有肉食螨變應原的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供了一種肉食螨變應原的制備方法。

本發明肉食螨變應原中的螨是指普通肉食螨(Cheyletus eruditus)。雌螨，體長為450～620微米；軀體無色，呈菱形；顎體比較狹長，氣門板呈M狀；須肢跗節上，外方有13～15個硬齒，內方有16～17個齒；前足體板的前緣比后緣短，有4對梳狀緣毛。后半體板狹，有3對剛毛。第一對足長度中等。雄螨，比雌螨寬，更骨化；前復片為縱向的脊，有幾個結節，無顯著的側突或側翼；復片有縱向的條紋；須肢跗節上，外方有8～9個硬齒，內方有6～9個齒；前足體板比雌螨寬，具有2對中毛及4對緣毛。后半體板伸向體軀后緣，有5或6對緣毛；生殖孔位于體軀后緣，陽莖稍彎曲。

本發明第一方面是提供了普通肉食螨變應原原材料的制備方法。

普通肉食螨變應原原材料通過種子建立、接種培養、收集、純化等步驟制備。

1)種子建立

螨種收集：廣泛收集起居室床上、枕頭、被褥、沙發、地毯等中的粉塵以及房舍灰塵。24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環境中培養2～4個月。

分離鑒定：每周觀察2～3次粉塵、灰塵中螨生長情況，發現有普通肉食螨活動時，接種針挑出，對普通肉食螨進行形態學鑒定，確認普通肉食螨后，將普通肉食螨分離出來，進行培養。

種子培養：培養基為：豬肉粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，經過鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細胞培養瓶，每個培養瓶以無菌操作接入20～30克培養基，然后接入1.0～1.5克上述已分離鑒定好的普通肉食螨，24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環境中 避光培養2～3個月。至普通肉食螨達到50％左右作為種子。普通肉食螨種子于20℃～25℃、相對濕度為50～70％條件下避光保存，每3～6個月傳代一次。

2)接種培養：培養基為：豬肉粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培養基各成分分別通過100目以上的分樣篩，經過鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細胞培養瓶，每個培養瓶以無菌操作接入20～30克培養基，然后接入1.0～1.5克普通肉食螨工作種子。將接種好的培養瓶置于24℃～27℃、相對濕度為60～75％條件下避光培養2～3個月。

3)收集：將培養瓶內的普通肉食螨與培養基的混合物倒入準備好的不銹鋼盤中，放入-80℃冰箱過夜，真空冷凍干燥48h以上。

4)純化：將普通肉食螨原材料通過100目分篩，超聲篩分純化，取其篩上部分，鏡檢普通肉食螨含量95％以上為合格。

5)脫脂：加入2倍體積的-20℃以下丙酮脫脂，振蕩30min后靜置5min，重復操作，直至上清液無色為止。

6)干燥：棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開，真空干燥48h以上。

7)保存：-20℃以下密封避光保存。

本發明另一方面提供了普通肉食螨變應原的制備方法。

1)提取：普通肉食螨純螨變應原原材料與50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液按1～2∶20(W/V)的比例混合，2～8℃，攪拌提取24h。

2)離心：于4℃，8000rmp離心15～30分鐘。

3)過濾：過濾上清液濾紙過濾，0.22μm膜除菌過濾。

4)濃縮：用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液無色為止，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經0.22μm膜過濾除菌得普通肉食螨變應原原液。