[發(fā)明專利]一種用于竹節(jié)參分子鑒定的引物及序列特異擴增區(qū)域（SCAR）的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510724704.8
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105349534A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設計）人: 袁丁;張長城;劉朝奇;王婷;周志勇;何毓敏;許成;李菁
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 蔣悅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分子鑒定方法，具體為對竹節(jié)參的序列特異擴增區(qū)域標記分子鑒定方法。

背景技術(shù)

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖，具有滋補強壯、散瘀止痛、止血、祛痰的功效，用于病后虛弱，勞嗽咯血，咳嗽痰多，跌撲損傷，因此兼具我國北藥人參的滋補強壯和南藥三七的活血散瘀的作用，是我國西南地區(qū)土家族、苗族等聚居區(qū)常用中草藥。人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.、西洋參PanaxquinquefoliumL.、三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen等均以根莖入藥，中藥飲片外觀與竹節(jié)參相似，易造成混用。因此，尋找有效方法鑒別這些藥材，對于合理用藥具有重要意義。

與傳統(tǒng)中藥鑒定技術(shù)相比，DNA分子標記技術(shù)是直接利用植物DNA分子水平上的差異來進行鑒別，其結(jié)果不受植物生長年限、生理狀態(tài)以及生長環(huán)境的影響，更加客觀、可靠。目前已有多種DNA分子標記技術(shù)應用于植物的鑒別中，如隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internaltranscribedspacer，ITS)等。序列特異擴增區(qū)域(Sequencecharacteredamplifiedregion，SCAR)標記技術(shù)是在RAPD基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種穩(wěn)定性更高、特異性更強的分子標記，已應用于一些近緣物種的鑒別。

發(fā)明內(nèi)容

本文旨在建立一種SCAR分子標記技術(shù),用于快速準確鑒別竹節(jié)參及其近緣植物人參、西洋參以及三七。具體包括如下內(nèi)容：

植物樣本包括如下：

竹節(jié)參新鮮葉片采購于湖北恩施椿木營竹節(jié)參種植生產(chǎn)基地，三七的新鮮葉片采購于云南文山硯山縣者臘鄉(xiāng)，人參、西洋參的新鮮葉片購自于吉林省白山市靖宇縣。采集后用硅膠迅速干燥備用。

試劑包括如下：

PCR擴增試劑(ThermoScientific公司)、CTAB(AMRESCO公司)、PVP40(Sigma公司)、瓊脂糖(BIOWEST公司)、GelRed染料(BIOTIUM公司)、RNaseA(Sigma公司)、DNA上樣緩沖液(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司)、2×TaqPCRMastermix【天根生化科技(北京)有限公司】、1kbplusDNALadder【天根生化科技(北京)有限公司】。RAPD隨機引物由上海生工公司合成。其余試劑均為分析純。

儀器包括如下：

BS110S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、HH—4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、CT15RT高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)、梯度PCR儀(AppliedBiosystems)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、GeneGenius凝膠分析系統(tǒng)(英國SYNGNE公司)、LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)。

通過轉(zhuǎn)化RAPD分析結(jié)果從而獲得SCAR標記，步驟如下：

基因組DNA的提取：用液氮將研缽、大小杵，藥匙預冷，稱取200mg葉片和10％PVP(W/W)置于液氮中，迅速研磨成細粉；將研磨好的細粉轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，迅速加入4℃預冷的700μL去多糖buffer，混勻，在冰上靜置30min，4℃3000r·min^-1離心5min，棄上清，此步驟重復一次，棄上清，加入700μL65℃預熱的2×CTAB提取液，65℃水浴40min，每隔10min輕輕上下顛倒混勻一次，取出1.5mL離心管，冷卻至室溫，12000r·min^-1離心10min；取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇的混合液，混勻10min，12000r·min^-1離心10min，取上清，重復此步驟一次，取上清至新的1.5mL離心管，加入0.6倍體積的-20℃預冷的異丙醇，混勻，于-20℃靜置1h，4℃12000r·min^-1離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，用吹風機冷風吹干液體，干燥后，加入30μL滅菌ddH₂O和0.5μLRNaseA，37℃水浴1h，于-20℃保存?zhèn)洌?/p>