[發明專利]一種用于竹節參分子鑒定的引物及序列特異擴增區域（SCAR）的方法

在審

• 申請號: 201510724704.8
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105349534A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 袁丁;張長城;劉朝奇;王婷;周志勇;何毓敏;許成;李菁
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 蔣悅

1.一種用于竹節參分子鑒定的引物，其特征在于，所述的引物為Z1，其序列為：F5’-AGACGTCCACATGGGCTA-3’；R5’-TAGACGTCCACGTTAAGTTAG-3’。

2.采用權利要求1所述的特異性引物Z1進行竹節參序列特異性擴增區域(SCAR)標記分子的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

基因組DNA的提取：用液氮將研缽、大小杵，藥匙預冷，稱取200mg葉片和10％PVP(W/W)置于液氮中，迅速研磨成細粉；將研磨好的細粉轉移至1.5mL離心管中，迅速加入4℃預冷的700μL去多糖buffer，混勻，在冰上靜置30min，4℃3000r·min^-1離心5min，棄上清，此步驟重復一次，棄上清，加入700μL65℃預熱的2×CTAB提取液，65℃水浴40min，每隔10min輕輕上下顛倒混勻一次，取出1.5mL離心管，冷卻至室溫，12000r·min^-1離心10min；取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇的混合液，混勻10min，12000r·min^-1離心10min，取上清，重復此步驟一次，取上清至新的1.5mL離心管，加入0.6倍體積的-20℃預冷的異丙醇，混勻，于-20℃靜置1h，4℃12000r·min^-1離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，用吹風機冷風吹干液體，干燥后，加入30μL滅菌ddH₂O和0.5μLRNaseA，37℃水浴1h，于-20℃保存備；

SCAR分析：應用特異性SCAR引物Z1對竹節參及其它人參屬植物基因組DNA進行PCR擴增，其中，特異性SCAR引物Z1序列為：F5’-AGACGTCCACATGGGCTA-3’；R5’-TAGACGTCCACGTTAAGTTAG-3’；SCAR-PCR反應體系為：模板DNA1μL，2×TaqPCRMastermix12.5μL，上下游引物各1μL，加滅菌ddH2O補齊至25μL，其中，上下游引物濃度均為10mmol/L；SCAR-PCR擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環34次；72℃補充延伸5min，取PCR反應產物20μL，在100V電壓下，經1.5％瓊脂糖凝膠(含GelRed)電泳30min，GeneGenius凝膠分析系統檢測照相，即可完成竹節參的序列特異性擴增區域(SCAR)標記分子的鑒定。

3.權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，SCAR-PCR反應體系為：模板DNA1μL，2×TaqPCRMastermix12.5μL，上下游引物各1μL，加滅菌ddH₂O補齊至25μL，其中，上下游引物濃度均為10mmol/L。

4.權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，SCAR-PCR擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環34次；72℃補充延伸5min。