[發明專利]估算煙草N導入片段右端長度的分子標記、引物及方法

在審

• 申請號: 201510724310.2
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105200149A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 劉勇;陳姝敏;李永平;黃昌軍;于海芹;肖炳光
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

本發明涉及一種估算煙草N導入片段右端長度的分子標記、引物及方法。該分子標記為Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列。本發明估算方法是以TN5.51引物對或TN5.34引物對為引物以待檢測的包含N導入片段的煙草基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，然后電泳檢測，如擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料Coker176相當；如沒有擴增出，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Coker176短。該方法可以簡便、快速、高通量地應用于煙草TMV抗病基因定位和選育煙草抗TMV品種中，有利于減少與N基因連鎖的累贅。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別是涉及估算煙草N導入片段右端長度的分子標記、引物及方法。本發明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在煙草TMV抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。

背景技術

煙草花葉病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)是我國煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列。生產上主要采取培育無毒苗、藥劑防治和銷毀田間病殘體等措施進行防治，在控制TMV的發生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部田塊爆發的情況仍然時有發生，造成較大的經濟損失。因此，種植TMV抗病品種依然是防控TMV最根本同時也是最經濟有效的手段。抗病品種的推廣需要抗性高、且無產量劣勢和農藝性狀劣勢的品種。

目前煙草的TMV抗源主要來源于煙草野生種心葉煙(N.glutinosa)，其抗性由一個顯性單基因(N)控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一個NBS類抗病基因。N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因組序列大小為6656bp，包括5個外顯子和4個內含子，屬于TIR-NBS-LRR類型抗病基因。N基因的抗病機理為在病毒侵染位點出現過敏性壞死斑(枯斑)，通過誘導產生的細胞過敏性死亡限制TMV在植物體內的移動。在介導了過敏反應后，煙草植株能夠獲得系統性抗性，對TMV或其它類似病原的再次入侵產生廣譜抗性。通過一系列的常規雜交和回交轉育，N基因的抗性從心葉煙轉育至香料煙中，然后轉育至煙草品種中。采用雜交育種轉育N基因的抗性，實際上是轉育包含N基因的野生煙染色體片段(簡稱為N導入片段)。世界上抗TMV煙草育種利用的幾乎都是N導入片段。代表性品種是較早商業化種植的包含N導入片段的抗TMV煙草品種Coker176和Speight H20。由于產量較低、上部葉落黃較慢等連鎖累贅，包含N導入片段的煙草品種不能滿足生產的迫切需要。已有研究證明N基因本身無產量和產值的連鎖累贅，連鎖累贅來源于N導入片段上的其他基因。N導入片段較短的枯斑資源，推測其連鎖累贅可能較小，育種利用潛力較大。盡管N基因在20年前被克隆，但N導入片段的長度和伴隨的累贅基因一直不清楚，限制了的N基因在商業品種中的應用。常規育種技術無法估算N導入片段的長度，產量、落黃和烘烤等性狀為數量性狀，在育種早期難以選擇。估算煙草N導入片段長度的技術手段缺乏，導致抗TMV煙草育種缺乏突破性進展。因此如何克服現有技術的不足是目前煙草抗TMV育種技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種估算煙草N導入片段右端長度的分子標記、引物及方法，該分子標記、引物及方法可用于篩選N導入片段較短的資源和育種單株，達到減少N導入片段的連鎖累贅的效果，為選育出高抗TMV，且無明顯產量和質量劣勢的煙草品種提供技術手段。

本發明的目的是提供估算煙草N導入片段右端長度的分子標記。

本發明的另一目的是提供一種估算煙草N導入片段右端長度的PCR擴增方法所用的引物對。

本發明的又一目的是提供一種估算煙草N導入片段右端長度的方法。