[發明專利]估算煙草N導入片段右端長度的分子標記、引物及方法

在審

• 申請號: 201510724310.2
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105200149A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 劉勇;陳姝敏;李永平;黃昌軍;于海芹;肖炳光
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

1.一種估算煙草N導入片段右端長度的方法在選育煙草抗TMV品種和在煙草TMV抗病基因定位中的應用，其特征在于步驟如下：

以TN5.51引物對或TN5.34引物對為引物，以待檢測的包含N導入片段的煙草基因組DNA為模板，進行PCR 擴增，擴增產物進行電泳檢測，如擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在分子標記位置與抗病對照材料Coker176無差異；如沒有擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Coker176短；所述分子標記為Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列；其中，

當以所述的TN5.51引物對進行PCR 擴增，如果擴增出845bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.1所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料Coker176無差異；如沒有擴增出845bp大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Coker176短；

當以所述的TN5.34引物對進行PCR 擴增，如果擴增出648bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.2所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料Coker176無差異；如沒有擴增出648bp大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Coker176短；

所述的TN5.51引物對的序列如下：

TN5.51-F1：5’-ttcgggtttttagttcggttt-3’，

TN5.51-R1：5’-aggcaccatgtcacaaaaca-3’；

所述的TN5.34引物對的序列如下：

TN5.34-F1：5’-cactttggcctctcacacaa-3’，

TN5.34-R1：5’-aaacttgttcatagtctgcgaat-3’。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的PCR 的反應體系如下：

DNA模板50 ng/μL 2.5 μL，

10×PCR buffer 2.0 μL，

dNTPs 2.5mM 1.2 μL，

引物對中的引物10umol/μL 各1.5 μL，

Ex-Taq DNA酶5U/μL 0.3 μL，

ddH2O 余量，

總體積為20 μL。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的PCR反應程序：94℃預變性5min；然后進入35個循環：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循環結束后72℃延伸10min；4℃保存。