[發(fā)明專利]一種犬腺病毒Ⅱ型IgG抗體檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510724056.6
• 申請(qǐng)日: 2015-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105403699B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐青海;闞云超;姚倫廣;唐存多;劉宗才;焦鑄錦;李丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南陽(yáng)師范學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 洛陽(yáng)公信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)41120
• 代理人: 孫笑飛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬腺病毒Ⅱ型IgG抗體檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

犬腺狀病毒是哺乳動(dòng)物腺病毒屬中致病性最強(qiáng)的一種病毒。有2個(gè)血清型——血清Ⅰ型腺病毒既可引起犬傳染性肝炎又可引起狐貍腦炎,故又稱狐貍腦炎與犬傳染性肝炎病；血清Ⅱ型可引起犬傳染性喉氣管炎和腸炎，經(jīng)血清Ⅱ型腺病毒所制備的疫苗免疫過(guò)的動(dòng)物能夠抵抗血清Ⅰ型和血清Ⅱ型腺病毒的攻擊，因此現(xiàn)在臨床應(yīng)用的主要是基于血清Ⅱ型腺病毒所制備的商品化疫苗。本病呈全球流行,而且廣泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等動(dòng)物中。本病一年四季均可發(fā)生,各種性別、年齡和品種的犬、狐均易感染,但其中以離乳至一歲的動(dòng)物,發(fā)病率和死亡率最高。犬作為一種與人類接觸最為親密的、與人類相處時(shí)間最長(zhǎng)的寵物之一，與人類的日常生活已經(jīng)密不可分，其健康狀況往往與人類自身的健康狀況息息相關(guān)，因此，關(guān)注寵物犬的健康對(duì)于動(dòng)物福利和人類健康具有重要的公共衛(wèi)生意義。

目前我國(guó)對(duì)于其特異性抗體的檢測(cè)方法主要有間接免疫熒光檢測(cè)法、ELISA檢測(cè)法、膠體金法和病毒中和試驗(yàn)。其中病毒中和試驗(yàn)，是現(xiàn)在疫苗企業(yè)評(píng)價(jià)犬腺病毒疫苗的主要方法，該方法需要臨時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)要求高、難以高通量檢測(cè)，而且操作人為因素影響大，而僅限于個(gè)別實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用，無(wú)法批量工業(yè)化生產(chǎn)，而不能推廣到基層養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī)院臨床一線檢測(cè)之用。間接免疫熒光檢測(cè)法是一種特異性和敏感性很高的檢測(cè)方法，但是受溫度、PH值、蛋白質(zhì)濃度影響較大，目前臨床應(yīng)用方面尚有待進(jìn)一步研究。膠體金便于臨床定性分析犬腺病毒抗體陽(yáng)性與陰性問(wèn)題，而無(wú)法做到精確定量。ELISA是一項(xiàng)國(guó)內(nèi)外通用的，目前在各個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域技術(shù)最為成熟的一種方法，商品化的試劑盒也非常好用。然而，目前國(guó)內(nèi)的技術(shù)力量沒(méi)有達(dá)到相應(yīng)的國(guó)際水平，遲遲沒(méi)有中國(guó)自己的犬腺病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒上市。

鑒于上述情況，開(kāi)發(fā)一種能夠適合工業(yè)化批量生產(chǎn)、質(zhì)量可控、性能穩(wěn)定、高通量、成本低廉、特異性和敏感性好的犬腺病毒Ⅱ型抗體檢測(cè)試劑盒十分必要，特別重要的是，該試劑盒的成本不能太高，否則，難以推廣應(yīng)用。基于以上種種背景，建立了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種犬腺病毒Ⅱ型所制備的疫苗IgG抗體檢測(cè)試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明為解決上述問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是：一種犬腺病毒Ⅱ型IgG抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒內(nèi)設(shè)有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板5塊、120mL10倍濃縮洗滌液1瓶、120mL樣品稀釋液1瓶、50 μL陽(yáng)性血清1管、50 μL陰性血清1管、20 μL辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的SPA酶標(biāo)抗體1管、60mL底物顯色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物顯色液B液2管。

所述包被犬腺病毒抗原96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板的制備方法，包括以下步驟：

（1）、將培養(yǎng)單層犬腎細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒掉，然后向培養(yǎng)瓶中加入PBS洗滌液，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PBS洗滌液為0.027mL，之后搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使洗滌液覆蓋單層犬腎細(xì)胞面，以除去培養(yǎng)瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS洗滌液后備用；

（2）、向步驟（1）處理過(guò)的培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA-Na₂溶液，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的胰酶-EDTA-Na₂溶液為0.015mL，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶直至胰酶-EDTA-Na₂溶液覆蓋單層犬腎細(xì)胞，室溫下靜置3min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na₂溶液，然后在溫度為37℃條件靜置5min，振動(dòng)培養(yǎng)瓶直至單層犬腎細(xì)胞全部脫落，備用；

（3）、向步驟（2）處理過(guò)的培養(yǎng)瓶中加入MEM培養(yǎng)基，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的MEM培養(yǎng)基溶液為0.4mL，且MEM培養(yǎng)基中胎牛血清的質(zhì)量濃度為5%，用移液槍吹散犬腎細(xì)胞，直至犬腎細(xì)胞呈單個(gè)分布，即制得細(xì)胞懸液，備用；

（4）、用排槍吸取步驟（3）制備的細(xì)胞懸液，并以每孔100μL的量加入到96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中，振動(dòng)免疫檢測(cè)反應(yīng)板，使細(xì)胞懸液在孔內(nèi)均勻分布，之后將載有細(xì)胞懸液的免疫檢測(cè)反應(yīng)板放入溫度為37℃、CO₂體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，倒掉96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中的細(xì)胞懸液，并用PBS洗滌溶液清洗，備用；