[發(fā)明專利]一種犬腺病毒Ⅱ型IgG抗體檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510724056.6
• 申請(qǐng)日: 2015-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105403699B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐青海;闞云超;姚倫廣;唐存多;劉宗才;焦鑄錦;李丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南陽(yáng)師范學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 洛陽(yáng)公信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)41120
• 代理人: 孫笑飛

1.一種犬腺病毒Ⅱ型IgG抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于：該試劑盒內(nèi)設(shè)有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板5塊、120mL10倍濃縮洗滌液1瓶、120mL樣品稀釋液1瓶、50μL陽(yáng)性血清1管、50μL陰性血清1管、20μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的SPA酶標(biāo)抗體1管、60mL底物顯色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物顯色液B液2管；

所述包被犬腺病毒抗原96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板的制備方法，包括以下步驟：

（1）、將培養(yǎng)單層犬腎細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒掉，然后向培養(yǎng)瓶中加入PBS洗滌液，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PBS洗滌液為0.027mL，之后搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使洗滌液覆蓋單層犬腎細(xì)胞面，以除去培養(yǎng)瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS洗滌液后備用；

（2）、向步驟（1）處理過(guò)的培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA-Na₂溶液，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的胰酶-EDTA-Na₂溶液為0.015mL，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶直至胰酶-EDTA-Na₂溶液覆蓋單層犬腎細(xì)胞，室溫下靜置3min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na₂溶液，然后在溫度為37℃條件靜置5min，振動(dòng)培養(yǎng)瓶直至單層犬腎細(xì)胞全部脫落，備用；

（3）、向步驟（2）處理過(guò)的培養(yǎng)瓶中加入MEM培養(yǎng)基，每cm²單層犬腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的MEM培養(yǎng)基溶液為0.4mL，且MEM培養(yǎng)基中胎牛血清的質(zhì)量濃度為5%，用移液槍吹散犬腎細(xì)胞，直至犬腎細(xì)胞呈單個(gè)分布，即制得細(xì)胞懸液，備用；

（4）、用排槍吸取步驟（3）制備的細(xì)胞懸液，并以每孔100μL的量加入到96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中，振動(dòng)免疫檢測(cè)反應(yīng)板，使細(xì)胞懸液在孔內(nèi)均勻分布，之后將載有細(xì)胞懸液的免疫檢測(cè)反應(yīng)板放入溫度為37℃、CO₂體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，倒掉96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中的細(xì)胞懸液，并用PBS洗滌溶液清洗，備用；

（5）向步驟（4）處理過(guò)的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中加入無(wú)血清MEM培養(yǎng)基稀釋過(guò)的稀釋倍數(shù)為100倍的犬腺病毒Ⅱ型，使每孔病毒感染復(fù)數(shù)為5TCID₅₀，之后將96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板放入溫度為37℃、CO₂體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h，再把96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板的液體倒掉，并用PBS洗滌溶液清洗，在溫度為30℃的真空干燥儀內(nèi)干燥1h，直至孔邊緣處出現(xiàn)白色圈；

（6）、向步驟（5）處理過(guò)的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中加入固定液，靜置30min后棄去固定液，放入溫度為30℃的真空干燥儀內(nèi)干燥，直至孔邊緣出現(xiàn)白色圈，所述固定液是將丙酮與PBS洗滌溶液按35:65的體積比混合并攪拌均勻后制得；

（7）、將步驟（6）制得的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板抽真空后置于溫度為-20℃下保存，即制得包被犬腺病毒Ⅱ型抗原的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板；

所述底物顯色液A液的制備方法是將去離子無(wú)菌水、體積百分比濃度為30%的雙氧水和pH為5.0、摩爾濃度為0.1mol/L的乙酸鹽緩沖液按5:0.026:5的體積比混合并攪拌均勻后制得；

所述底物顯色液B液的制備方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg 3-氨基-9-乙基咔唑，混合并攪拌均勻后即可。