[發明專利]一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的Taqman Real-time PCR試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201510719725.0
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105274256A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 吳錦艷;田宏;尚佑軍;陳妍;王光祥;劉湘濤;張志東;欒志舫;王耀杰;臧金鳳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

技術領域

本發明涉及豬圓環病毒檢測技術領域，具體說是一種用于檢測豬圓環PCV1病毒的TaqmanReal-timePCR試劑盒，本發明還包括該試劑盒的使用方法。

背景技術

豬圓環病毒(Porcinecircovirus)屬于圓環病毒科，圓環病毒屬成員。豬圓環病毒(PCV)為二十面體對稱、無囊膜、單股環狀DNA病毒。病毒粒子直徑為17nm，是目前發現的最小的動物病毒。根據致病性、抗原性和核酸序列的差異，將PCV分為PCV-1和PCV-2。PCV-1無致病性，1974年由德國學者Tischer從多株連續傳代的PK-15細胞中最先發現，1982年證實該病毒來源于當初制備PK-15細胞的豬腎組織。后來證實該病毒只是一種可以感染豬的常規病毒，不會對感染豬造成危害，但PCV1感染在世界各地都有報道，感染豬后也能產生血清抗體，且可污染豬源細胞系。在流產與死亡的胎兒中被檢出，提示其可垂直傳播。Saha等報道，PCV1感染能引起豬胚胎肺組織出現病理變化。Krakows等認為，PCV1與豬細小病毒聯合接種可引起仔豬結腸袢出現肉芽腫性淋巴結炎。可見，PCV可能具有潛在致病性或影響疾病的發展，因此有必要加強對PCV1的調查及檢測研究。

PCV2是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PostweaningMultisystemicwastingsyndrome，PMWS),皮炎與腎病綜合征(PNDS)的主要病原，PCV感染可引起豬的免疫抑制，從而使機體更易感染其他病原，這也是圓環病毒與豬的許多疾病混合感染有關的原因。最常見的混合感染有豬瘟、PRV(偽狂犬病毒)、PPV(細小病毒)、肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、PEDV(流行性腹瀉病毒)、SIV(豬流感病毒)，有的呈二重感染或三重感染，其病豬的病死率也將大大提高，有的可達25％～40％。PCVl的發現及今后對于該病毒的研究最終取決于與PCV2表征的鑒別區分，伴隨著PCV2出現的一些疾病癥狀及給養豬業帶來的損失已日趨嚴重,如何迅速發現并防控這一疾病在全球范圍內的感染將是獸醫、診斷專家和研究者多學科跨領域間合作的一個重要議題。

目前應用于PCV1的檢測技術多為病毒分離、間接免疫熒光、免疫過氧化物單層培養(IPMA)、ELISA(酶聯免疫吸附實驗)，聚合酶鏈式反應(PCR)，核酸探針雜交及原位雜交試驗(ISH)等方法。但是大部分是針對PCV2的，關于PCV1的檢測目前還是個空白，因此，急需建立一種可以準確診斷PCV1和PCV2的敏感、特異、重復性好的檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服目前國內市面缺乏用于準確鑒別診斷PCV1與PCV2的特異性檢測的技術手段的難題，提供一種用于能夠快速、敏感、準確以及低成本地檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，本發明還提供該試劑盒的使用方法，本試劑盒及其使用方法還適用于檢測低微含量的豬圓環病毒PCV1。

為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案：

一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，所述試劑盒包含擴增預混液、陽性對照、無RNA酶水、序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物及SEQIDNO:3的探針引物的混合物。

所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物混合物包括：

SEQIDNO:1：上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT

SEQIDNO:2：下游引物GTTACAGATGGCGCCGAAAGACG

探針引物序列為：

SEQIDNO:3：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG

所述探針引物的5’端標記物為FAM報告熒光基團、3’端標記物為TAMRA淬滅熒光基團。

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延長的序列：

SEQIDNO:4(180bp)：

gaaaggtaggggtagggggttggtgccgcctgagggggggaggaactggccgatgttgaaccgcagctggttaacattccaagatggctgcgagtgtcctccttctatggtgagtacaaattctctagaaaggcgggaattgaagatacccgtctttcggcgccatctgtaac。

所述陰性對照為無RNA酶水。

所述陽性對照為含有豬圓環病毒PCV1基因序列的陽性質粒pGM-173，其構建方式如下：