[發明專利]一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的Taqman Real-time PCR試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201510719725.0
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105274256A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 吳錦艷;田宏;尚佑軍;陳妍;王光祥;劉湘濤;張志東;欒志舫;王耀杰;臧金鳳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，所述試劑盒包含擴增預混液、陽性對照、無RNA酶水、序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物及SEQIDNO:3的探針引物的混合物，其特征在于所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物序列為：

SEQIDNO:1：上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT；

SEQIDNO:2：下游引物GTTACAGATGGCGCCGAAAGACG。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在于所述探針引物序列為：

SEQIDNO:3：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG。

3.根據權利要求1所述的豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在于所述引物混合物擴增出的條帶序列為：

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延長的序列：

SEQIDNO:4（173bp）：

gaaaggtaggggtagggggttggtgccgcctgagggggggaggaactggccgatgttgaaccgcagctggttaacattccaagatggctgcgagtgtcctccttctatggtgagtacaaattctctagaaaggcgggaattgaagatacccgtctttcggcgccatctgtaac。

4.根據權利要求1、2或3所述的一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在于所述引物濃度均的10pmol/μL，擴增引物及探針引物體積配比為1:1:1。

5.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照為構建的pGM-173陽性質粒以及利用其制作的標準曲線。

6.一種如權利要求1所述檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒的使用方法，其特征在于所述實時熒光定量RT-PCR包括以下步驟：

a.使用權利要求1所述的檢測試劑盒進行PCR擴增，條件如下：94℃預變性2min；94℃20s，退火溫度55.5℃30s，72℃20s，40個循環；

b.結果分析

根據擴增結果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽性；Ct值介于35-40為可疑，需重復檢測；再次測定時該樣品Ct值<35為陽性，Ct值≥35為陰性；也可以依擴增得到的Ct值根據標準曲線對起始樣品中病毒含量進行準確定量。

7.一種如權利要求6所述檢測豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒的使用方法，其特征在于所述實時熒光定量RT-PCR的反應體系為：

a.OneStepRT-PCRbuffer：12.5份；

b.引物混合液3份

c.酶混合物1份;

d.無RNA/DNA酶水5.5份；

e.提取樣品的RNA模板3份；

f.陽性對照pGM-173陽性質粒3份；

g.陰性對照無RNA/DNA酶水3份。

8.根據權利要求7所述的豬圓環病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在于所述反應體系中的引物混合液3份為引物濃度為10pmol/μl的三條引物混合液，其中173bp上游引物1份，173bp下游引物1份，探針引物1份。