[發(fā)明專利]一種胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存保護液及凍存方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510718538.0
• 申請日: 2015-10-28
• 公開（公告）號: CN105165803A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;麥錦連;李平
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細胞領(lǐng)域，具體涉及一種胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存保護液及凍存方法。

背景技術(shù)

干細胞(stemcell)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC具有自我復制、自我更新、多方向分化潛能、造血支持以及免疫調(diào)控等特性。在特定的機體外分化環(huán)境下，能夠誘導分化為神經(jīng)、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細胞，被認為是細胞治療技術(shù)的最有希望的來源細胞之一。除此以外，間充質(zhì)干細胞能分泌多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括血管內(nèi)皮生長因子(vEGF)、胎盤生長因子(PGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)等在內(nèi)的各種生長因子，這些生長因子可參與多種細胞反應(yīng)，促進細胞生長，而收集條件培養(yǎng)基是獲得這些活性成分的有效方法。

人羊膜來源于人胎盤組織，無血管、神經(jīng)及淋巴，羊膜屬于孕婦生產(chǎn)后的廢棄物，一個胎盤的羊膜面積大約有600cm²，而且羊膜易于從胎盤剝離，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特點而被認為是目前間充質(zhì)干細胞的最佳來源，是未來干細胞在醫(yī)療應(yīng)用上具有巨大潛力的理想種子細胞。

間充質(zhì)干細胞在體外經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存復蘇后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。因此，研究一種有效的胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存方法，使具有臨床應(yīng)用價值的胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞能在體外長期保存并維持原有的多向分化能力，顯得尤為重要。

胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存需要將處于對數(shù)生長期的細胞收集起來，加入含有特定成分的細胞凍存保護液制成單細胞懸液，分裝于凍存管中置于超低溫冰箱或者液氮中進行長期凍存。

目前現(xiàn)有技術(shù)中，胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的細胞凍存保護液配方一種是以DMSO和血清為主要成分，另一種是以培養(yǎng)基、DMSO和血清為主要成分。此外還有一些配方是在上述兩種配方的基礎(chǔ)上添加其他保護細胞的物質(zhì)。但上述配方凍存胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞均效果不理想，復蘇后細胞回收率及細胞活率低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存保護液及凍存方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存保護液，包括

DMSO10v/v％-20v/v％

胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基30v/v％-80v/v％

胎牛血清10v/v％-50v/v％。

其中，所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞的凍存保護液中所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法為：取P1-P5代的胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞酶解消化后傳代，連續(xù)培養(yǎng)24-72h后，收集培養(yǎng)上清，離心后取上清。

在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述P1-P5代的胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞優(yōu)選為匯合度80-90％胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞。

在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述酶解消化具體為向細胞中加入0.015mL/cm²-0.04mL/cm²的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，完全培養(yǎng)基終止酶解。

在一些優(yōu)選實施方案中，所述終止酶解的完全培養(yǎng)基的加入量為消化液體積的5倍～10倍。

在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法中所述傳代為酶解消化后的細胞離心，完全培養(yǎng)基重選后，按80000個細胞/cm²-15000個細胞/cm²的傳代密度傳代，細胞連續(xù)生長24h-72h。

其中，所述酶解消化后的離心優(yōu)選為200g-400g離心5min。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明所述完全培養(yǎng)基的組成為DMEM-F1280v/v％-95v/v％，F(xiàn)BS5v/v％-20v/v％。

本發(fā)明所述胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法在胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞傳代后收集培養(yǎng)上清，離心后取上清獲得胎盤羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基。其中，所述離心優(yōu)選為200g-400g離心5min。