[發明專利]一種分泌型Sema4C蛋白及其應用

在審

• 申請號: 201510699053.1
• 申請日: 2015-10-21
• 公開（公告）號: CN105259348A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 馬丁;高慶蕾;魏軍成;楊潔;喬龍
• 申請（專利權）人: 珠海雅馬生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術領域

本發明屬于醫學生物技術領域，尤其涉及一種新發現的分泌型Sema4C蛋白及其應用，具體地為一種可用于乳腺癌早期檢測及術后監測的以分泌型Sema4C蛋白為腫瘤標志物的ELISA(酶聯免疫吸附測定法)試劑盒的制備及應用。

背景技術

乳腺癌發病率居女性患者第一位，約占女性所患全部惡性腫瘤的23％。據國家衛計委資料顯示，2004-2005年，中國女性乳腺癌的死亡率為5.9/10萬，居惡性腫瘤死亡率的第6位。近15年間，我國乳腺癌發病和死亡的年齡調整率及絕對死亡人數均明顯上升，是近年來惡性腫瘤增長幅度最大的腫瘤，且呈年輕化趨勢。面對如此嚴峻的形式，國家衛計委及時開展兩癌篩查以期早期發現乳腺癌，在一定程度上明顯降低了局部晚期乳腺癌(LABC)的發病率，使乳腺癌患者病死率明顯降低。但乳腺癌患者術后隨訪時間長，除影像學外尚無明確的腫瘤標記物，嚴重影響了乳腺癌患者的術后監測，導致不易發現的腫瘤局部復發和轉移，是乳腺癌患者的重要死因。因此，臨床上迫切需要發現乳腺癌新的血清學腫瘤標志物用于乳腺癌的無創性早期診斷、術后評價治療效果和隨訪監測，以期早期發現乳腺癌的復發和轉移。

腫瘤標志物的價值表現在其敏感性和特異性上。理想的腫瘤標志物應該是敏感性高，特異性強，表達量或血清中水平與腫瘤組織擴散或腫塊大小成正相關。臨床上目前尚無乳腺癌特異的腫瘤標志物檢測，常常使用腫瘤標志物CEA、CA153用于乳腺癌患者的檢測。由于CEA的多克隆抗體容易與樣品中無關抗原結合，造成假陽性結果增多。腫瘤標志物CA153也存在著同樣的問題，特異性不高。因此，尋找一種兼顧敏感性和特異性的血清學腫瘤標志物，應用于乳腺癌的臨床檢測，以期達到乳腺癌早期診斷、術后監測及預后評估的目的是乳腺癌診治中迫切需要解決的課題。

ELISA技術自本世紀70年代出現開始，就因其高度的準確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快以及費用低等優點，在臨床和生物疾病的診斷與控制等領域倍受重視，成為檢驗中最為廣泛應用的方法之一。特別是隨著蛋白質分離純化技術和基因工程技術的不斷發展，各種高純度抗體、抗原和抗體復合物得以制備，以及單克隆抗體技術的應用，使得該診斷檢測技術在特異性、靈敏度和客觀性等方面都有了大幅度的提高，并且在自動化免疫技術的推進之下進一步具有了精確的定量分析能力。由于ELISA的技術條件要求低、攜帶方便、常以試劑盒的形式出現且易商品化、操作簡便和經濟實惠，已成為一種應用最為廣泛和發展最為成熟的生物檢測與分析技術。

膜型Sema4C蛋白(Semaphorin4C)是一個由833個氨基酸組成的分子量約為93.5KDa的酸性蛋白質，屬于腦信號蛋白家族，最初是在神經系統研究中而得，對它的深入研究發現，在健康成人體內膜型Sema4C蛋白表達極微弱，但在各類癌癥患者包括乳腺癌、宮頸癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌和卵巢癌等多種病變組織中可檢測到顯著高表達。

但是，膜型Sema4C蛋白在應用中存在諸多缺陷，例如，膜型Sema4C蛋白不能通過Elisa檢測，必須利用免疫組化技術，免疫組化技術的前提必須把腫瘤組織切除下來后檢測，用于腫瘤轉移和術后復發監測極不方便，而分泌型Sema4C蛋白可以很好的克服上述缺陷。

SEMA4C基因是發明人早期通過激光捕獲、顯微切割(LCM)技術從乳腺癌患者及良性乳腺腫瘤患者中切取人淋巴管內皮細胞，微量RNA提取后經無偏性線性擴增，最后進行表達譜芯片檢測發現，并進行臨床標本驗證的在乳腺癌中表達上調最為明顯的基因。

國內外目前關于Sema4C在腫瘤中的研究非常有限，尤其是目前尚無分泌型Sema4C蛋白的序列、濃度及檢測方法的相關報道，更無相關專利。

因此，如果能夠建立分泌型Sema4C的ELISA檢測方法，在基礎研究和臨床醫學檢測方面都有重要的應用價值。

發明內容

鑒于現有技術存在的問題，本發明提供了一種分泌型Sema4C蛋白，不僅首次證實了分泌型Sema4C蛋白的存在，并發現該分泌型Sema4C蛋白在正常人和腫瘤患者血清中的表達有顯著差異，尤其在乳腺癌淋巴結轉移患者血清中明顯升高，并與乳腺癌患者腫瘤負荷呈顯著正相關，因此能作為一種理想的血清學標記物用于乳腺癌患者的術前診斷、術后治療效果評估及隨訪監測，更進一步提供了一種以分泌型Sema4C蛋白為腫瘤標志物的試劑盒，解決了膜型Sema4C蛋白不能通過Elisa檢測而必須利用免疫組化技術使用不便的問題。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：