[發明專利]一種基因分型檢測方法

在審

• 申請號: 201510698148.1
• 申請日: 2015-10-23
• 公開（公告）號: CN105219864A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: 張明
• 申請（專利權）人: 張明
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 劉莉

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種基因分型檢測方法。

背景技術

目前臨床實驗室最常用的ABO血型的鑒定方法是血清學血凝試驗和微柱凝膠實驗，另外ABO血型的基因型檢測多用于正反定型不符的臨床個案以及疑難血型的鑒定等。血凝試驗是指抗體和紅細胞在液體介質中發生肉眼可見的凝集反應。根據操作的不同又分為玻片法、試管法和全自動微板法。血凝學方法屬于初篩方法，但對一般弱表達的ABO血樣以及凝集可疑的血樣往往不能給出判讀結果。微柱凝膠法(MGT)采用凝膠技術進行抗球蛋白試驗可提高試驗的靈敏度和特異性。但是紅細胞濃度過低或過高而離心不徹底、血清中含纖維蛋白出現細胞“凝塊”、細菌污染等，可能導致MGT假陰性或假陽性。針對ABO基于分子水平的基因檢測目前常見的主要是引物特異性擴增(SSP)然后凝膠電泳觀察條帶，但該方法后續的凝膠電泳步驟最終需要目測觀察結果，增大了人工誤差的風險，并且因為開蓋電泳也增大了實驗室污染的風險。

目前HLA-B27等位基因的檢測方法主要是淋巴細胞毒性實驗，引物特異性擴增和流式細胞儀檢測等方法。淋巴細胞毒性實驗的方法由于抗體親和力較弱，效價低，易產生交叉反應嚴重影響了分型結果的可靠性。引物特異擴增技術也就是傳統SSP方法，雖然是基于分子水平的分型技術，但是由于操作需要電泳觀察條帶來判定，操作復雜并且人為誤差大。采用流式細胞技術成本較高，需要洗板等，操作復雜，并且需要批量操作才有意義。不適合用于疾病快速診斷的需要。

發明內容

為了彌補上述現有技術的不足，本發明提出一種基因分型檢測方法。

本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：

一種基因分型檢測方法，包括如下步驟：

(1)將待測基因加入PCR反應液中形成混合液并封閉在PCR反應板上進行PCR擴增反應，所述PCR反應液中包含待測基因的擴增引物和特異性探針、以及內參照引物和內參照探針，所述特異性探針和所述內參照探針的5’端用熒光基團標記且3’端用淬滅基團標記，在所述PCR擴增反應前讀取所述混合液的本底熒光值，在PCR擴增反應結束后讀取反應后的熒光值；

(2)將所述反應后的熒光值減去所述本底熒光值，若增值大于等于90％，則判定所述待測基因為陽性，若增值小于90％則判定所述待測基因為陰性。

本發明與現有技術對比的有益效果是：本發明的反應是封閉在PCR反應板上進行，反應前和反應后的熒光值數據讀取工作都在該封閉的環境中進行，PCR反應后污染的風險被完全剔除，整個操作非常的簡單、方便，通過反應前后的熒光值增值來對待測基因進行分型，這樣的定性分析剔除了SSP技術肉眼觀察產生誤差的可能。

具體實施方式

下面結合優選的實施方式對本發明作進一步說明。

本發明提供一種基因分型檢測方法，在具體實施方式中包括如下步驟：

(1)將待測基因加入PCR反應液中形成混合液并封閉在PCR反應板上進行PCR擴增反應，所述PCR反應液中包含待測基因的擴增引物和特異性探針、以及內參照引物和內參照探針，所述特異性探針和所述內參照探針的5’端用熒光基團標記且3’端用淬滅基團標記，在所述PCR擴增反應前讀取所述混合液的本底熒光值，在PCR擴增反應結束后讀取反應后的熒光值；(2)將所述反應后的熒光值減去所述本底熒光值，若增值大于等于90％，則判定所述待測基因為陽性，若增值小于90％則判定所述待測基因為陰性。

其中，各個所述特異性探針上的熒光基團以及所述內參照探針上的熒光基團均不同，熒光基團可以從以下群組中選擇：FAM、HEX、TET、ROX、TAMRA和CY5；淬滅基團可以為Dabcyl。

以下通過更具體的實施例對本發明進行詳細說明。

實施例一：待測基因為ABO基因的O1、O2、B、A、A2基因型

(a)提取血樣中基因組DNA

使用德國inno-train公司的全血DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作過程按其說明書進行。

(b)設計擴增引物

從GenBank中找出待檢測的ABO基因序列，用Lasergene軟件的MegAlign功能對比序列，在ABO各種分型基因中設計通用擴增引物，然后將擴增引物放入NCBI中的Blast進行擴增的特異性檢驗，以確保其只對ABO各個分型進行特異性擴增。同時設計內參照引物。設計的通用的擴增引物和內參照引物見下表1-1，其中F表示正向引物，R表示反向引物。