[發(fā)明專(zhuān)利]Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510680779.0
• 申請(qǐng)日: 2015-10-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105177161B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮濤;李崎;馬燕琳;李玉帥;劉沙沙;沈珺瑤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京嘉寶仁和醫(yī)療科技有限公司;海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 北京名華博信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11453
• 代理人: 張玉樞

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的檢測(cè)試劑，包括引物組合物，針對(duì)Y染色體AZF區(qū)域和其他作為內(nèi)部參考的特異性區(qū)域選定的引物位點(diǎn)設(shè)計(jì)了引物序列，這些引物序列的特點(diǎn)為：（1）每組引物均是以基因組上一段序列為模板來(lái)設(shè)計(jì)三條連續(xù)的引物，這三條引物連接后形成PCR模板；（2）在正常人染色體目標(biāo)區(qū)域，引物位點(diǎn)序列存在已知且不變的拷貝數(shù)，且在目標(biāo)區(qū)域之外的其他染色體區(qū)域不存在該序列；（3）這些序列引物具有接近的退火溫度，波動(dòng)范圍<5℃；（4）與通用擴(kuò)增引物序列不存在互補(bǔ)性；（5）內(nèi)參位點(diǎn)僅在目標(biāo)區(qū)域唯一出現(xiàn)，在基因組其他區(qū)域不存在該位點(diǎn)。還提供了檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的試劑盒以及檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用gDNA或外周血游離DNA檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的試劑盒及使用該試劑盒體外檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的方法。

背景技術(shù)

有研究報(bào)告指出，不育夫婦占已婚育齡夫婦的15％，其中男性因素約占一半，而男性不育癥35％是由于遺傳因素造成。Y染色體微缺失是除克式綜合征外男性不育的最主要遺傳因素。Y染色體大量的重復(fù)序列和回文結(jié)構(gòu)在維持Y染色體進(jìn)化穩(wěn)定性的同時(shí)，也使Y染色體更容易發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致染色體部分缺失或重復(fù)。Y染色體微缺失主要發(fā)生在Y染色體上的AZF(azoospermia factor)區(qū)。AZF區(qū)包括AZFa、AZFb、AZFc三個(gè)亞區(qū)，這些位置包括許多與精子形成有關(guān)的基因，這些區(qū)域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子發(fā)生障礙、少精、弱精甚至無(wú)精癥狀。

檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失現(xiàn)在已經(jīng)成為男性不育專(zhuān)科的常規(guī)檢查，可以為男性不育患者找出病因，為遺傳咨詢提供依據(jù)；也為臨床醫(yī)生的診斷與后續(xù)治療提供指導(dǎo)。所以一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確度高且低成本的檢測(cè)方法對(duì)臨床具有重大意義。

目前檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的方法有很多，例如多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、芯片雜交、MLPA等技術(shù)，最常用的是使用多重PCR擴(kuò)增序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence Tagged Site,STS)。該方法選擇AZFa、AZFb、AZFc區(qū)的STS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)條帶的有無(wú)判斷AZF各區(qū)是否發(fā)生缺失。歐洲男科協(xié)會(huì)(European Academy of Andrology,EAA)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)聯(lián)合發(fā)布的《Y染色體微缺失分子診斷實(shí)踐指南》推薦了多重PCR檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的6個(gè)STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基礎(chǔ)上，各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可選擇性地增加STS的數(shù)量進(jìn)行更精確的檢測(cè)。這種方法簡(jiǎn)單易行，目前使用最廣泛。但是這種方法擴(kuò)增的STS位點(diǎn)較少(6個(gè)或以上)，而且電泳只能定性檢測(cè)目的產(chǎn)物是否存在，不能檢測(cè)拷貝數(shù)的變化，這對(duì)于Y染色體AZF區(qū)部分缺失的情況可能檢測(cè)不精確，所以這種方法在檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度上還有待提高。其中一個(gè)方法是增加檢測(cè)的STS數(shù)量，但這需要進(jìn)行多次多重PCR反應(yīng)，從而大大增加實(shí)驗(yàn)工作量和檢測(cè)成本。

檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失還可以使用多重實(shí)時(shí)熒光PCR，這種方法簡(jiǎn)便快速更準(zhǔn)確，但是探針設(shè)計(jì)繁瑣并且需要報(bào)告基團(tuán)修飾，價(jià)格昂貴，不適合臨床推廣使用。

有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)采用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失，相比于多重PCR技術(shù)，可以極大地提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度。但缺點(diǎn)是該方法需要設(shè)計(jì)大量的探針，成本較高，另外檢測(cè)信號(hào)分析也較為復(fù)雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。

MRC-Holland公司推出一款SALSA MLPA probe-mix kit P360-A1試劑盒，用于Y染色體AZF區(qū)微缺失的檢測(cè)，通過(guò)雜交、連接手段獲取探針相對(duì)拷貝數(shù)信號(hào)，并根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度識(shí)別對(duì)應(yīng)探針，最終通過(guò)探針信號(hào)給出檢測(cè)結(jié)論。該技術(shù)手段與芯片雜交技術(shù)一樣，面臨著檢測(cè)信號(hào)分析復(fù)雜的缺陷，另外由于需要根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度識(shí)別探針，在探針設(shè)計(jì)和識(shí)別上有著一定的局限性。