[發明專利]一種細胞毒性增強的高效靶向殺傷NK/CIK細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201510676843.8
• 申請日: 2015-10-15
• 公開（公告）號: CN105176927B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 叢秀麗
• 申請（專利權）人: 叢秀麗
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

本發明公開了一種細胞毒性增強的高效靶向殺傷NK/CIK細胞的制備方法，適用于外周血、臍血來源的NK/CIK和DC?NK/CIK細胞培養；包括血液采集及單個核細胞分離、采用懸浮的細胞培養NK/CIK細胞、采用貼壁的單核細胞培養DC細胞、將NK/CIK細胞和DC細胞和按照10：1按比例進行混合培養；本發明采用未經分選的單個核細胞進行培養，利用高效的細胞因子組合，培養14天后，在體系中產生NK/CIK混合效應細胞，細胞純度近90％，其中52.4％的NK細胞和33.3％的CIK細胞，表達殺傷標志的細胞占80％以上，所有的NK細胞高表達活化標志CD161；誘導的DC?NK/CIK細胞具有顯著的增殖能力和靶向殺傷腫瘤的能力，尤其針對NK細胞不敏感的腫瘤細胞，其殺傷能力顯著提高，擴大了NK細胞臨床治療腫瘤的范圍。

技術領域

本發明涉及NK/CIK細胞的制備方法，具體為一種細胞毒性增強的高效靶向殺傷NK/CIK細胞的制備方法。

背景技術

單個核細胞：指血液或者骨髓經Ficoll分離后得到的具有單個細胞核的白細胞。其主要分為兩大群體，即單核細胞與淋巴細胞。

NK細胞(natural killer,NK)：是機體天然免疫的主要承擔者，幾乎參與了免疫系統的發生、發展及效應等重要環節的調節過程，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關。NK細胞主要分布于外周血中，占PBMC 5-10％，淋巴結和骨髓中也有NK活性，但水平較外周血低。NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，稱為自然殺傷活性。NK細胞在IL-2刺激下可發生增殖反應，活化NK細胞可產生IFN-γ。其殺傷介質主要有穿孔素、細胞毒因子和TNF等，以及ADCC作用。

CIK細胞(cytokine-induced killer)：是多種細胞因子誘導的殺傷細胞，是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞。CIK細胞同時表達CD3⁺和CD56⁺兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。

DC細胞：又稱樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)，是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。DC與腫瘤的發生、發展有著密切關系，大部分實體瘤內浸潤的DC數量多則患者預后好。

腫瘤的傳統治療方法常用的有手術、放療和化療三種，但這三種方法均不能徹底清除體內的瘤細胞，而免疫治療借助于調節腫瘤細胞和宿主免疫反應，來刺激免疫系統識別和殺傷腫瘤細胞。其中，體內回輸免疫活性細胞的過繼免疫療法具有一定的抗腫瘤效果。與其它的抗腫瘤藥物相比，對機體免疫系統的結構和功能不產生損傷，可以直接殺傷腫瘤細胞，并且調節和增強機體的免疫功能，因而成為治療腫瘤的重要輔助手段，為預防腫瘤復發，改善晚期患者的生存質量提供了新途徑。

過繼性免疫治療是指將有免疫活性的自體或者同種異體的免疫細胞輸給患者，為患者提供現成的免疫力，以達到治療目的的治療方法。為了達到更好的抗腫瘤效果，用于過繼免疫療法的免疫活性細胞必須具有較強的細胞毒活性和增殖能力。

目前應用IL-2為主要刺激因子擴增了自然殺傷細胞(NK)、淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、CD3活化殺傷細胞(CD3AK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)等多種細胞毒效應細胞用于過繼免疫治療，臨床試驗結果顯示具有較好的應用前景，這些效應細胞是以NK為主或富含NK樣細胞。