[發明專利]一種細胞毒性增強的高效靶向殺傷NK/CIK細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201510676843.8
• 申請日: 2015-10-15
• 公開（公告）號: CN105176927B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 叢秀麗
• 申請（專利權）人: 叢秀麗
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種細胞毒性增強的高效靶向殺傷NK/CIK細胞的制備方法，其特征在于，包括以下幾個步驟：

一、血液采集及單個核細胞分離

(1)、采集外周血或者臍血50～80mL，收集在含肝素鈉抗凝劑的采血袋中，迅速搖勻，避免發生凝血；

(2)、將采血袋和生物冰袋一起放入保溫箱，保持溫度為4～8℃；12小時內運送至實驗室；

(3)、將血液以等體積生理鹽水稀釋混勻，緩慢疊加于離心管中的淋巴細胞分離液之上，使稀釋的血液與淋巴細胞液的體積比為3:2，注意保持液層分界清晰；

(4)、將離心管在900g、20℃的條件下離心25min，離心完畢后，可觀察到離心管中液面分層，將單個核細胞層的液體，移入新的離心管中；

(5)、用2倍于單個核細胞層的液體體積的生理鹽水稀釋單個核細胞層液體，在400g、4℃下離心5min進行洗滌；洗滌兩次后去除上清；

(6)、用無血清培養液重懸單個核細胞，調節細胞密度為3×10⁶/mL，于37℃、5％體積濃度的CO₂培養箱中孵育1小時，分別收集懸浮細胞和貼壁的單核細胞；

二、DC細胞培養

(1)、用DC細胞完全培養液重懸步驟一的(6)中得到的貼壁的單核細胞，調整細胞濃度為1×10⁶/mL，并加入終濃度為50～100ng/mL的細胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的細胞因子IL-4，于37℃、5％體積分數的CO₂培養箱中培養；

(2)、培養第3天，半量補充新鮮的DC細胞完全培養液培養液和細胞因子GM-CSF和IL-4，并向每mL的細胞培養液中加入100～200μg的腫瘤細胞裂解液，于37℃、5％體積濃度的CO₂培養箱中繼續孵育16～24小時；

(3)、加入促熟細胞因子組合，于37℃、5％體積濃度的CO₂培養箱中繼續孵育16～24小時；

(4)、收集成熟DC細胞；

所述步驟二的(3)中所述的促熟細胞因子組合為每mL的細胞培養液中加入10～20μg的poly(IC)、5～10μg的LPS、500～1000IU的IFN-γ和10～20ng的TNF-α；

所述步驟二的(1)中的DC細胞完全培養為含1％質量分數的人血白蛋白的X-VIVO無血清培養液；

三、NK/CIK細胞培養

(1)、收集步驟一的(6)中得到懸浮細胞，離心后，用NK/CIK細胞完全培養液重懸細胞，調節細胞密度為3～5×10⁶/mL，向每mL的細胞中添加細胞因子200-500U的IL-2、50-100ng的OKT3和20-50μg的PHA，于37℃、5％體積濃度的CO₂培養箱中培養3～5天，收集細胞，1500rpm下離心，去除上清，生理鹽水洗滌一次；

(2)、 用新鮮的完全培養液重懸細胞，調整細胞密度為1～2×10⁶/mL，向每mL的細胞中添加200-500U的細胞因子IL-2和5-20ng的IL-15繼續培養；

(3)、在培養第5天，將得到的NK/CIK細胞和步驟二的(4)中得到DC細胞和按照10：1比例進行混合培養；每2-3天添加新鮮培養基，向每mL的細胞液中添加細胞因子200～500U的IL-2和5～20ng的IL-15，維持細胞密度為1～2×10⁶/mL；

(4)、培養第14天，收集細胞，流式細胞儀檢測表型以及進行細胞計數，計算增殖能力；

所述步驟三(1)中的NK/CIK細胞完全培養液為含1～5％質量分數的人AB血清的X-VIVO無血清培養基。