[發明專利]一種Y形DNA組裝結合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201510675257.1
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105352922B
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 陳俊華;莊莉;周順桂
• 申請（專利權）人: 廣東省生態環境與土壤研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 胡輝,許飛

技術領域

本發明屬于環境分析化學領域，涉及一種汞離子檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及一種Y形DNA組裝結合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

汞離子（Hg²⁺）對人體健康存在多種危害，能夠在生物體內累積，可通過食物鏈轉移至人體內，具有很強的致癌、致畸、致突變性。人體內的累積的微量Hg²⁺無法通過自身代謝進行排泄，將導致心臟、肝、神經系統病變，甚至引起癌變。因此，對Hg²⁺的高靈敏檢測具有重要意義。傳統的汞離子檢測方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質譜法等。然而這些技術通常需要復雜的操作與樣品前處理過程以及昂貴的儀器，嚴重制約了這些檢測方法的應用。已報道的一些生物傳感器用于汞離子的檢測往往需要涉及探針標記，或者固定洗滌過程，操作步驟麻煩，檢測靈敏度不夠。因此，開發一種操作簡單、成本低廉、無需標記、無需分離洗滌的高靈敏汞離子檢測方法和檢測試劑盒具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術的不足，建立一種Y形DNA組裝結合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒。

本發明所采取的技術方案是：

一種超敏汞或銀離子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系、核酸外切酶Ⅲ和雙鏈DNA熒光染料，其特征在于：核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中序列A的5’到3’端依次為a區、b區和通用凸出區d；序列B的5’到3’端依次為c區、a*區和通用凸出區d；序列C的5’到3’端依次為b*、c*和通用凸出區d；序列D的5’到3’端依次為d*區和保護序列；a、b、c區分別和a*、b*、c*區序列互補配對，d*區和通用凸出區d互補配對后至少存在一組不配對的T-T對或C-C對；保護序列為不含4個或以上連續的T或C的隨機序列。

進一步的，a、b、c區序列的長度獨立為9～21個堿基。優選的，a、b、c區序列的長度獨立為12～17個堿基。

d區序列的長度獨立為9～15個堿基。

序列D的保護序列至少具有6個堿基。

d*區和通用凸出區d互補配對后存在2～6組不配對的T-T對或C-C對。

緩沖體系不與待測離子反應生成沉淀。

雙鏈DNA熒光染料選自SYBR Green I、EB、Gene finder。

一種超敏汞或銀離子檢測方法，包括如下步驟：

1)將核酸序列A、B、C于緩沖體系混合，使其相互雜交形成Y形復合體，加入雙鏈DNA熒光染料；

2)在緩沖體系中繼續加入核酸序列D、核酸外切酶Ⅲ和待測樣品，繼續反應；

3)根據反應體系的熒光值變化情況確定汞離子的濃度；

其中，核酸序列A～D的結構如上所述。

本發明的有益效果是：

1)以形成的Y形DNA為傳感檢測平臺，只需簡單雜交即可完成反應，操作簡單，價格低廉。

2)無需標記修飾，無需分離洗滌過程，方便快速檢測。

3)以核酸外切酶擴增信號，檢測靈敏度高，選擇性好。

本發明方法對汞的檢測限為5pM，線性范圍從10pM～100nM，線性范圍大。

附圖說明

圖1是本發明的檢測原理示意圖；

圖2為對不同濃度的Hg²⁺檢測的結果圖；

圖3為特異性實驗結果圖。

具體實施方式

一種超敏汞或銀離子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系、核酸外切酶Ⅲ和雙鏈DNA熒光染料，核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中序列A的5’到3’端依次為a區、b區和通用凸出區d；序列B的5’到3’端依次為c區、a*區和通用凸出區d；序列C的5’到3’端依次為b*、c*和通用凸出區d；序列D的5’到3’端依次為d*區和保護序列；a、b、c區分別和a*、b*、c*區序列互補配對，d*區和通用凸出區d互補配對后至少存在一組不配對的T-T對或C-C對；根據檢測離子的不同，保護序列為不含4個或以上連續的T（檢測汞離子時）或C（檢測銀離子時）的隨機序列。

進一步的，a、b、c區序列的長度獨立為9～21個堿基。優選的，a、b、c區序列的長度獨立為12～17個堿基。d區序列的長度獨立為9～15個堿基。

這是因為上述區域的序列過短，則形成的Y型DNA復合體不夠穩定，且與雙鏈DNA熒光染料反應產生的熒光比較弱，不利于檢測；而序列過長則可能形成二級結構，不利于核酸外切酶Ⅲ的切割，對離子的檢測效果都有不利的影響。