[發明專利]一種煙曲霉生物膜流動模型

在審

• 申請號: 201510666979.0
• 申請日: 2015-10-16
• 公開（公告）號: CN105296362A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 陳一強;羅勁;李冰;孔晉亮
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種煙曲霉生物膜流動模型及流動裝置。

背景技術

煙曲霉是一種常見的條件致病性真菌，其孢子體積微小，直徑2～3μm，漂浮于空氣中，經呼吸道進入人體，肺部是曲霉感染主要發生部位。當宿主免疫力低下或者肺部的防御機制下降時，可引起過敏性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）、曲霉瘤或侵襲性曲霉?。↖A）。而煙曲霉感染中90％為侵襲性感染，臨床表現缺乏特異性，死亡率高。近年的研究表明煙曲霉菌可分泌大量胞外基質，在感染病灶中形成生物被膜，加重真菌的耐藥性。煙曲霉感染已經受到眾多臨床工作者和科研者的關注。目前國外關于曲霉流動和靜止模型下生物被膜成膜能力仍存在爭議，曲霉的研究模型尚無定論。而國內研究人員大多研究的是靜止模型的生物膜形態及結構，相關的藥物干預亦是針對靜止模型狀態的生物膜形態和結構的研究，但靜止模型的生物膜形態和生物體內的生物膜形態是存在差異的，生物體內由于血液的流動以及其他因素的影響，因此在靜止模型下研究出的藥物，具體實施到生物體內，卻達不到預期的效果。這已成為了限制煙曲霉生物膜及其相關的藥物干預研究的一大難題。

發明內容

本發明的目的是解決現有大多研究靜止模型的煙曲霉生物結構及形態，提供一種更加接近于生命體內煙曲霉生物膜的形態和結構的研究模型，提供一種煙曲霉生物流動模型。為實現本發明目的所使用的技術方案為：

一種煙曲霉生物膜流動模型，包括制備煙曲霉孢子懸液、建立生物膜流動模型和胞外基質染色及CLSM觀察生物膜形成；

（1）制備煙曲霉孢子懸液：將受試煙曲霉菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS緩沖液沖洗斜面收集孢子，用MOPS緩沖后調pH值為6.9-7.1的RPMI-1640液體培養基重懸孢子，光學顯微鏡下用血細胞板計數懸液中的孢子量，用上述RPMI-1640液體培養基將計數好的孢子懸液稀釋，調整孢子終濃度為1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流動模型：連接流動裝置，所述的流動裝置包括蠕動泵，進液儲液瓶，硅橡膠管，止水夾，單向排氣裝置，chamber，廢液收集瓶；蠕動泵與進液儲液瓶通過硅橡膠管連接，與進液儲液瓶的硅橡膠管即進液端，蠕動泵與單向排氣裝置通過硅橡膠管連接，單向排氣裝置和chamber通過硅橡膠管連接，距chamber兩端2-4cm處的硅橡膠管上各設置一個止水夾，chamber和廢液收集瓶通過硅橡膠管，將連接好的流動裝置至于35-37℃恒溫培養箱中，泵0.5%次氯酸鈉的儲液瓶消毒，隨后高速流通無菌雙蒸水清洗流動裝置，滅菌清洗完畢后，連接泵入RPMI-1640培養基，將配制備好的孢子懸液以300μL/channel從chamber上游注入，夾閉兩端，倒置2-4小時后開通，菌體表面流速為0.1-0.5mm/s；培養8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基質染色，CLSM觀察生物被膜的形態；

（3）胞外基質染色及CLSM觀察生物膜形成：無菌生理鹽水緩慢清洗chamber中的生物膜，無菌注射器注入300μL制備好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分鐘，泵無菌去離子水洗去多余染液，然后置于CLSM下觀察，激發光和濾過光的波長分別為488nm和BP515-530nm。

優選地，將所述的流動裝置的置于35-37.0℃恒溫生化培養箱中，流動裝置進液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸鈉的儲液瓶中，出液端硅橡膠管開口置入廢液收集瓶中，啟動蠕動泵，調節泵速為1.5-2.0rpm，持續4-5h泵入0.5%次氯酸鈉消毒于整個流動裝置；隨后將進液端硅橡膠管入口置入含1.5-2L滅菌雙蒸水的燒瓶中，以30-50rpm泵速高速流通無菌雙蒸水3-4h清洗流動裝置，同時開啟恒溫培養箱內的紫外射線消毒燈消毒整個裝置外表面及其恒溫培養箱內部，直至滅菌清洗完畢；