[發明專利]一種煙曲霉生物膜流動模型

在審

• 申請號: 201510666979.0
• 申請日: 2015-10-16
• 公開（公告）號: CN105296362A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 陳一強;羅勁;李冰;孔晉亮
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚

1.一種煙曲霉生物膜流動模型，其特征在于，包括制備煙曲霉孢子懸液、建立生物膜流動模型和胞外基質染色及CLSM觀察生物膜形成；

（1）制備煙曲霉孢子懸液：將受試煙曲霉菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS緩沖液沖洗斜面收集孢子，用MOPS緩沖后調pH值為6.9-7.1的RPMI-1640液體培養基重懸孢子，光學顯微鏡下用血細胞板計數懸液中的孢子量，用上述RPMI-1640液體培養基將計數好的孢子懸液稀釋，調整孢子終濃度為1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流動模型：連接流動裝置，所述的流動裝置包括蠕動泵，進液儲液瓶，硅橡膠管，止水夾，單向排氣裝置，chamber，廢液收集瓶；將連接好的流動裝置至于35-37℃恒溫培養箱中，泵0.5%次氯酸鈉的儲液瓶消毒，隨后高速流通無菌雙蒸水清洗流動裝置，滅菌清洗完畢后，連接泵入RPMI-1640培養基，將配制備好的孢子懸液以300μL/channel從chamber上游注入，夾閉兩端，倒置2-4小時后開通，菌體表面流速為0.1-0.5mm/s；培養8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基質染色，CLSM觀察生物被膜的形態；

（3）胞外基質染色及CLSM觀察生物膜形成：無菌生理鹽水緩慢清洗chamber中的生物膜，無菌注射器注入300μL制備好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分鐘，泵無菌去離子水洗去多余染液，然后置于CLSM下觀察，激發光和濾過光的波長分別為488nm和BP515-530nm。

2.根據權利要求1所述的煙曲霉生物膜流動模型，其特征在于，所述的步驟（2）建立生物膜流動模型：將所述的流動裝置的置于35-37.0℃恒溫生化培養箱中，流動裝置進液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸鈉的儲液瓶中，出液端硅橡膠管開口置入廢液收集瓶中，啟動蠕動泵，調節泵速為1.5-2.0rpm，持續4-5h泵入0.5%次氯酸鈉消毒于整個流動裝置；隨后將進液端硅橡膠管入口置入含1.5-2L滅菌雙蒸水的燒瓶中，以30-50rpm泵速高速流通無菌雙蒸水3-4h清洗流動裝置，同時開啟恒溫培養箱內的紫外射線消毒燈消毒整個裝置外表面及其恒溫培養箱內部，直至滅菌清洗完畢；

將流動裝置進液端管硅橡膠管開口置入經MOPS緩沖后pH值為6.9-7.1的RPMI-1640液體培養基的儲液瓶中，培養液溫度為35-37℃，調節蠕動泵泵速為3-5rpm，持續泵入5-10min，使RPMI-1640液體培養基充滿整個裝置管道；暫時停止蠕動泵，于距chamber上游2-2.5cm處夾閉止水夾，用75%酒精消毒該段硅橡膠管，用1mL滅菌注射器將步驟（1）中配制備好的濃度為1-3×10⁵孢子/ml的孢子懸液以300μL/channel的接種量，從該段管道注入chamber，進液完畢后退出注射針頭，將chambe下游的硅橡膠管用止水夾夾閉，將chamber倒置使其觀察面朝下，靜置2-4小時使孢子沉降并粘附于各chamber內各channel的觀察面；孢子粘附完成后，將chamber轉置使各channel的觀察面朝上，再次開啟蠕動泵，調節泵速為1.75rpm，菌體表面流速為0.2mm/s；于37.0℃恒溫培養8h、16h、24h、48h、72h后，停止蠕動泵，對上述各個時點各個channel觀察面上形成的煙曲霉生物膜進行胞外基質染色，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察生物被膜的形態。

3.根據權利要求1所述的煙曲霉生物膜流動模型，其特征在于，所述的流動裝置還可以用75%乙醇進行消毒，消毒后，用轉速為50-100rmp的無菌雙蒸水清洗。

4.根據權利要求1所述的煙曲霉生物膜流動模型，其特征在于，所述的步驟（2）孢子懸液在chamber倒置2小時后開通。

5.根據權利要求1所述的煙曲霉生物膜流動模型，其特征在于，所述的步驟（2）泵流速為1.75rpm，菌體表面流速為0.2mm/s。