[發明專利]檢測丁草胺的時間分辨熒光免疫試劑盒

在審

• 申請號: 201510664251.4
• 申請日: 2015-10-15
• 公開（公告）號: CN106596949A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 杜霞;洪霞;劉靜
• 申請（專利權）人: 南京億特生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N33/533;G01N21/64
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技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測丁草胺的時間分辨熒光免疫分析試劑盒。

背景技術

丁草胺為酰胺類選擇性內吸傳導除草劑。丁草胺主要通過雜草的幼芽吸收，傳導全株而起作用，芽前和苗期均可使用。由于受到環境條件和人為因素的影響，每年在水稻旱播田都會出現不同程度的丁草胺藥害現象。因此定期對丁草胺殘留進行檢測成為許多國家的監控的必要手段。

丁草胺殘留分析一般使用氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）及氣相色譜質譜聯用技術（GC/MS），這些方法靈敏、準確，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復雜、繁瑣費時、檢測成本較高，而且需專業人員操作，很難滿足對樣品進行現場、批量、快速檢測的需要。因此，開發一種簡單快速、適用于農藥殘留現場監控的分析方法具有重要的現實意義。

而時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對丁草胺檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

發明內容

為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種蔬菜水果中丁草胺殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。

本發明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中丁草胺的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測農作物中丁草胺殘留量。

本發明目的之一是這樣實現的：檢測丁草胺的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、丁草胺標準品溶液、抗丁草胺的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。

本發明目的之二是這樣實現的：檢測丁草胺的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于：

(1) 免疫原的制備：將半抗原丁草胺與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，得到免疫原（丁草胺-BSA）；

(2) 包被原的制備：將半抗原丁草胺與卵血清白蛋白（OVA）偶聯，得到包被原（丁草胺-OVA）；

(3) 單克隆抗體的制備：

a. 用步驟(1)的免疫原（丁草胺-BSA）免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗丁草胺的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

b. 以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗丁草胺的單克隆抗體IgG；

c. 用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；

(4) 樣品的前處理及檢測：

取包被有包被原（丁草胺-OVA）的多孔包被板，加入50 μL的丁草胺到各自的微孔中，加50 μL以緩沖液稀釋的抗丁草胺抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μL Eu³⁺ -兔抗鼠抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，加200 μL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的丁草胺含量。

上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。

本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測丁草胺。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面：第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗丁草胺的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗丁草胺的單克隆抗體IgG。第二，Eu³⁺標記抗體的制備。

本發明測定方法：測定的基礎是標記免疫反應。包被有丁草胺-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗丁草胺抗體，振蕩反應，游離的丁草胺與微孔板上的丁草胺-OVA競爭抗丁草胺抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的丁草胺抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu³⁺-兔抗鼠抗體,進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu³⁺-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中丁草胺的量。

本發明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。

附圖說明

圖1為本發明的丁草胺標準品與抗體的TR-FIA標準抑制曲線圖。