[發(fā)明專利]特異性多肽探針修飾的金電極、其制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510659916.2
• 申請日: 2015-10-14
• 公開（公告）號: CN105445349A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李根喜;趙婧;陳稀嫻;呂赟
• 申請（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 上海上大專利事務(wù)所(普通合伙) 31205
• 代理人: 顧勇華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種特異性多肽探針修飾的金電極、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

精氨酸脫亞氨酶（PAD）是一種能夠催化蛋白質(zhì)分子中精氨酸殘基發(fā)生脫亞氨基作用并產(chǎn)生含瓜氨酸的蛋白質(zhì)的酶，它屬于水解酶類，通過水解作用產(chǎn)生的這一催化過程被稱為瓜氨酸作用。精氨酸脫亞氨酶屬于脒基轉(zhuǎn)移酶家族，廣泛分布于真核及原核生物中。目前，人體中PAD酶家族中的五種PAD酶已被廣泛識別，它們分布于不同的組織及細(xì)胞室中。其中，由于PAD4的特異性表達(dá)與多種疾病的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，因而關(guān)于PAD4的研究報(bào)道很多。而PAD4與其他PAD酶亞型有著嚴(yán)格的同源序列，因而它的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)機(jī)制可作為其他PAD家族酶類的研究模型。在許多人類疾病樣本內(nèi)都可以發(fā)現(xiàn)PAD4活性異常增高，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、阿茲海默綜合征、多發(fā)性硬化癥、狼瘡、帕金森綜合征甚至癌癥。其中，PAD4的特異性表達(dá)導(dǎo)致病變組織中非特異性蛋白的瓜氨酸化作用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性進(jìn)行性、以炎性滑膜炎為主的自身免疫性疾病，其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng)濕因子陽性，可最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍的軟骨的破壞畸形及功能喪失。這是在首先出現(xiàn)在40和60歲之間的患者中第二常見的關(guān)節(jié)炎癥狀。精氨酸脫亞氨酶4（PAD4）催化肽基精氨酸轉(zhuǎn)化為肽基瓜氨酸，與RA相關(guān)的PAD4基因突變已經(jīng)在相當(dāng)大的人群群體中被識別。RA病人能夠產(chǎn)生可以識別含有瓜氨酸的蛋白質(zhì)的自身抗體，而瓜氨酸化的蛋白水平與疾病的嚴(yán)重程度具有直接關(guān)聯(lián)，尤其在RA的形成階段，因而PAD4被廣泛認(rèn)為在RA的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為，PAD4是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新靶酶，檢測PAD4酶活性是研究其早期診斷方法與篩選治療新藥的重要內(nèi)容之一。

早期檢測PAD4活性是利用二乙酰一肟比色法測定酶反應(yīng)產(chǎn)物瓜氨酸的含量，從而達(dá)到檢測PAD4酶活的目的。其優(yōu)點(diǎn)是能批量快速檢測，但是強(qiáng)酸性的反應(yīng)條件限制了其檢測限的降低，測定限大約為0.2nmol/L。之后發(fā)展的PAD4檢測技術(shù)如高壓液相層析法、連續(xù)分光光度監(jiān)測法、ABAP測定法、熒光標(biāo)記ABPP測定法等，各有優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著諸如操作不易、耗資巨大、測定限不理想等弊端。近年來，伴隨著材料科學(xué)、表面技術(shù)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)等不同學(xué)科間的交叉深入，電化學(xué)技術(shù)正在不斷向前發(fā)展，其應(yīng)用范圍也更加廣泛，尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域中，更是發(fā)揮了十分重要的作用。而其中，以生物電化學(xué)又尤為突出。它是生物學(xué)與電化學(xué)的交叉學(xué)科，主要研究在生命過程中的電化學(xué)現(xiàn)象以及外電場對不同生物體系的影響，旨在揭示基于分子水平或超微結(jié)構(gòu)水平的相關(guān)生物事件的本質(zhì)和規(guī)律。由于具有操作簡單，試驗(yàn)周期短，特異性高，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)勢，生物電化學(xué)自出現(xiàn)以來就一直備受關(guān)注，如今更是成為研究的熱點(diǎn)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展以及醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、納米技術(shù)等更多現(xiàn)代學(xué)科的交叉融合，電化學(xué)將會在生命科學(xué)研究中占據(jù)越來越重要的份額。因此，本研究中我們提出了使用電化學(xué)檢測技術(shù)為表征手段的PAD4活性研究方案，以求達(dá)到成本更低、快速檢測的新方法的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在與提供一種特異性多肽探針修飾的金電極。

本發(fā)明的目的之二提供該金電極的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于用該金電極以實(shí)現(xiàn)對肽酰精氨酸脫亞胺酶4的活性檢測及其抑制劑的篩選。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下機(jī)理：PAD4可以水解蛋白質(zhì)中的精氨酸（Arg）進(jìn)行脫亞氨基形成瓜氨酸，所以我們選擇合成了一段含有堿性氨基酸即精氨酸的肽段，序列為GRGAGRGAC。這段肽段的末端是含有巰基的半胱氨酸，因?yàn)閹€基與金發(fā)生Au-S鍵結(jié)合，使肽段可自組裝到金電極表面，另一方面由于肽段含有作為PAD4酶反應(yīng)位點(diǎn)的精氨酸短肽重復(fù)序列，因而在pH=6.0的條件下在溶液中解離出的氨基多于氨基酸所帶的羧基，所以當(dāng)肽段組裝修飾到金電極表面后，電極表面修飾上了一層帶正電荷的多肽層。在本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)檢測pH條件下（pH=6.0），帶正電荷的肽段修飾的電極對同樣帶正電荷的電信號分子[Ru(NH₃)₅Cl]²⁺有靜電排斥作用，因而捕捉的電信號較小。當(dāng)金電極表面修飾的帶有精氨酸的多肽與PAD4酶反應(yīng)后，精氨酸即被水解脫亞氨基成為中性的瓜氨酸，于是電極表面的正電荷減少，此時(shí)對電信號分子的靜電排斥作用減弱，因此，當(dāng)修飾肽段與PAD4反應(yīng)后，電信號相應(yīng)增大。

根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：