[發(fā)明專利]一種低損傷的結(jié)直腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510647527.8
• 申請日: 2015-10-09
• 公開（公告）號: CN105154405B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙增仁;翟從劼;張峰;姜霞;唐宇杰
• 申請（專利權(quán)）人: 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 13100
• 代理人: 董金國;李志民

本發(fā)明涉及一種低損傷的結(jié)直腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：（1）組織前處理：將結(jié)直腸癌組織經(jīng)抗生素處理；（2）切塊；（3）培養(yǎng)：將切好的組織塊放入含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行初期培養(yǎng)和正常培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁。本發(fā)明的方法對細(xì)胞損傷小、細(xì)胞存活率高、操作簡便易培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低損傷的結(jié)直腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。多數(shù)結(jié)直腸癌患者就診時(shí)已屬中晚期，治療花費(fèi)大、效果差、遠(yuǎn)期生存率低。同時(shí)給患者、家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。結(jié)直腸癌具有較明顯的癌前及癌癥早期病變，且時(shí)間長達(dá)十余年。這為結(jié)直腸癌及癌前病變的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療提供了機(jī)會(huì)。腫瘤標(biāo)志物的測定在腫瘤的診斷、療效評估、檢測復(fù)發(fā)和推測預(yù)后等方面起到重要的作用，對提高臨床腫瘤診療水平具有重要的意義。

結(jié)直腸癌的發(fā)生是多基因變化過程，單一標(biāo)志物篩查特異性和敏感性較低，難以應(yīng)對大樣本人群的篩查。國內(nèi)外針對結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物方面的研究雖然很多，但是目前應(yīng)用于臨床的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物——CEA、CA199、CA125、CA724等仍缺乏足夠的靈敏性和特異性，尋找新的與結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物，對早期診斷及干預(yù)結(jié)直腸癌具有重要意義。但是迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)既靈敏又特異的腫瘤標(biāo)志物可應(yīng)用于臨床結(jié)直腸癌的檢測。因此，尋找有效腫瘤標(biāo)志物作為初篩手段、進(jìn)行結(jié)直腸癌早期篩查、早期診治對阻斷或延緩結(jié)直腸癌進(jìn)展、改善患者預(yù)后和延長生存期具有重要意義。

通過對結(jié)直腸癌組織細(xì)胞與正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞表達(dá)蛋白的高通量篩選，有可能發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與正常黏膜組織細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物。高通量篩選腫瘤細(xì)胞表達(dá)的蛋白則需要涉及到腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并且這種研究方法對原代培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)要求很高，要盡量避免實(shí)驗(yàn)操作中導(dǎo)致的細(xì)胞破裂或細(xì)胞膜損傷。

原代培養(yǎng)即為直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)，在結(jié)直腸癌的研究中，癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)未見報(bào)道采用機(jī)械破碎法直接生長，均采用傳統(tǒng)的酶消化法，其前期對結(jié)直腸癌組織進(jìn)行機(jī)械剪碎，然后向剪碎的組織中加入酶消化，使其分散成為單個(gè)細(xì)胞。

傳統(tǒng)的酶消化法具有以下缺陷：由于消化時(shí)間的原因（一個(gè)樣本只能選定相同的處理時(shí)間，比如以將略大的組織塊消化成單一細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)制定消化時(shí)間，必然造成較小的組織塊及游離細(xì)胞的消化過度），會(huì)造成細(xì)胞消化不均勻甚至消化過度，損傷細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞，影響細(xì)胞活性，或者消化不徹底不利于高通量篩選實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行；酶的種類繁多，在消化時(shí)選擇酶的種類和濃度具有多變性，不同的組織其對酶的要求也不一樣，需要復(fù)雜的條件摸索。

發(fā)明內(nèi)容

基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種對細(xì)胞損傷小、細(xì)胞存活率高、操作簡便易培養(yǎng)的低損傷的結(jié)直腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為：一種低損傷的結(jié)直腸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：

（1）組織前處理：將結(jié)直腸癌組織經(jīng)抗生素處理；

（2）切塊；

（3）培養(yǎng)：將切好的組織塊放入含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行初期培養(yǎng)和正常培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁。

進(jìn)一步的，步驟（1）將結(jié)直腸癌組織以無菌生理鹽水沖洗，然后放入含抗生素的無血清培養(yǎng)基浸泡。

更進(jìn)一步的，所述含抗生素的無血清培養(yǎng)基中抗生素為：500 U/mL 青霉素，500 μg/mL 鏈霉素，1.25 μg/mL 兩性霉素B，80μg/mL 慶大霉素。

進(jìn)一步的，步驟（2）切塊為：將組織塊放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)刀將組織切碎至體積1-50mm³，優(yōu)選15-30mm³。