[發(fā)明專利]羥乙基淀粉修飾的促紅細(xì)胞生成素模擬肽及其制備和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510633072.4
• 申請(qǐng)日: 2015-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN105418754A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏群超;鄭學(xué)敏;龔珉;周植星;徐為人;湯立達(dá)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津藥物研究院有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/505
• 分類號(hào): C07K14/505;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/10;A61K38/18;A61P13/12;A61P7/08;A61P7/06;A61P37/02;A61P35/00;A61P29/00;A61P39/06
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種羥乙基淀粉修飾的促紅細(xì)胞生成素模擬肽。具體地說，本發(fā)明涉及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)作用的羥乙基淀粉修飾的促紅細(xì)胞生成素模擬肽及其制備方法，本發(fā)明還涉及所述模擬肽在制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種糖蛋白激素。人類促紅細(xì)胞生成素基因位于7號(hào)染色體長22區(qū)。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重組技術(shù)開始大批量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)，廣泛用于臨床。應(yīng)用重組DNA技術(shù)已經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素(Egrie，JC，Strickland,TW，Lane，J等(986)免疫生物學(xué)(Immunobiol)72:213-224)，其是插入到中國倉鼠的卵巢組織細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中并且表達(dá)的克隆的人促紅細(xì)胞生成素基因的產(chǎn)物。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先翻譯成含有166個(gè)氨基酸并且166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯后修飾中，用羥肽酶裂解掉166位精氨酸。沒有糖基的人EP0的多肽鏈的分子量是18236Da,在完整的促紅細(xì)胞生成素分子中，糖基占整個(gè)分子量的大約40％(J.Biol.Chem.262:12059)。

促紅細(xì)胞生成素是最早應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子，是迄今所知作用最單一、且安全可靠的升血紅蛋白制劑。對(duì)于腎貧血、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤及陣發(fā)性夜間血尿等均有一定療效；此外，應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素還可減少手術(shù)中的輸血量，并能在一定程度上糾正由惡性腫瘤、化療及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血。由于促紅細(xì)胞生成素主要由腎小管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，腎性疾患引起的貧血是促紅細(xì)胞生成素的首選適應(yīng)證；促紅細(xì)胞生成素糾正腎性貧血的療效幾乎100％，但并不能改善腎功能。促紅細(xì)胞生成素的治療安全、有效，適合長期治療，也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術(shù)藥市場(chǎng)上，促紅細(xì)胞生成素類的重組藥物占了119億美元，有巨大的市場(chǎng)容量。

當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時(shí)，組織可以從已經(jīng)存在的紅血球中吸收足夠多的氧，此時(shí)體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素濃度很低，這種正常的較低的促紅細(xì)胞生成素濃度完全可以剌激促進(jìn)由于年齡的問題而正常損失的紅細(xì)胞。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的依靠紅細(xì)胞進(jìn)行氧輸送的水平被降低進(jìn)而出現(xiàn)缺氧情況時(shí)，促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的數(shù)量將會(huì)增加。作為對(duì)組織處于缺氧壓力的應(yīng)答，促紅細(xì)胞生成素水平的提高可以刺激紅組細(xì)胞的分化達(dá)到提高紅細(xì)胞生成的能力。當(dāng)體內(nèi)的紅細(xì)胞的數(shù)量大于正常組織的需求時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中促紅細(xì)胞生成素的水平被降低。正是由于促紅細(xì)胞生成素對(duì)于紅細(xì)胞的生成有著至關(guān)重要的作用，因此這類激素對(duì)于治療和診斷以紅細(xì)胞生成低下和缺陷為特征的血液病方面有著很廣泛的前景。

促紅細(xì)胞生成素的部分生物學(xué)效應(yīng)可以通過和細(xì)胞膜表面的受體內(nèi)在作用來調(diào)節(jié)。起先，使用從小鼠的脾臟里分離出的未成熟的紅細(xì)胞來研究細(xì)胞表面結(jié)合的促紅細(xì)胞生成素蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種蛋白是由兩種多聚肽組成，其分子量大約為85000-100000KD(Sawyer,etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3690-3694)由比較詳細(xì)的敘述。促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目也被計(jì)算出來了，大約每個(gè)細(xì)胞膜含有800-1000個(gè)位點(diǎn)。在這些結(jié)合位點(diǎn)中大約有300個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Kd水平為90pM，而剩下的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合力比較弱，大約有570pM。有研究表明從感染了friend病毒貧血株的小鼠的脾臟紅細(xì)胞對(duì)EP0的響應(yīng)情況發(fā)現(xiàn)，大約有400個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中Kd水平高的為100pM，Kd水平低的為800pM。

隨后的工作就是兩種促紅細(xì)胞生成素受體被單個(gè)基因翻錄，這個(gè)基因已經(jīng)被克隆。例如，小鼠和人的促紅細(xì)胞生成素受體的DNA序列以及編碼肽的序列在WO90/08822中已經(jīng)有敘述。目前的模型表明促紅細(xì)胞生成素結(jié)合到促紅細(xì)胞生成素受體導(dǎo)致了兩個(gè)促紅細(xì)胞生成素受體的活化和二聚，這種二聚進(jìn)一步導(dǎo)致了信號(hào)傳導(dǎo)的開始。

促紅細(xì)胞生成素克隆基因的應(yīng)用更有助于幫助尋找這些重要受體的激動(dòng)劑和拮抗劑。某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一組含有主要肽段的肽，這些肽可以和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并能剌激促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞的分化增殖。但是能夠刺激紅細(xì)胞增殖分化的肽的EC50卻很低，在20nM和250nM之間，因此這些肽在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。

發(fā)明內(nèi)容