[發明專利]一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物及其組合物

在審

• 申請號: 201510628746.1
• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN105296614A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 汪大為
• 申請（專利權）人: 北京晉祺生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京國昊天誠知識產權代理有限公司 11315
• 代理人: 劉昕

技術領域

本發明涉及貧血癥的檢測技術領域，尤其涉及一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物及其組合物。

背景技術

鐮刀形紅細胞貧血癥是一種常染色體隱性基因遺傳病，病患者的紅細胞在鏡下呈現出鐮刀形，其攜帶氧功能只有正常紅細胞的一半，在缺氧狀態下，這種不正常的紅細胞會破裂造成嚴重貧血，甚至引起病人死亡。鐮刀型細胞貧血癥主要發生在非洲及美國黑人中，我國的南方地區近年來也有病例報道。分子生物學研究發現，該病的發病原因是編碼血紅蛋白β亞基第六個氨基酸的基因序列由GAG突變成GTG，導致血紅蛋白β鏈該處的谷氨酸突變成纈氨酸，從而引起血紅蛋白的功能異常。這種突變表現出一定的共顯性，只攜帶一個突變基因的人群一般表型正常，此類型往往不需要治療,但其血液中還是存在一定比例的鐮狀紅細胞，在缺氧狀態下,這種紅細胞也會破裂導致一系列嚴重后果，因此這類攜帶者應避免高山等缺氧環境。

目前對鐮刀型貧血的基因檢測主要是直接測序法和PCR-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)。直接測序法可以直接獲得突變位點的序列，比較直觀，但操作繁瑣，耗時長，且需要使用昂貴的試劑和儀器，因此并不適合大規模推廣；PCR-RFLP則是在PCR反應后酶切產物，操作比較繁瑣，當樣本量較大時，很有可能引起樣本的交叉污染，因此也不是大樣本研究或檢測的最佳手段。因此，需找一種新的適于大量檢測樣本的鐮刀型貧血檢測方法和引物很有必要。

環介導等溫擴增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技術是日本科學家于2000年開發出來的一種恒溫擴增技術，針對靶基因的六個區域設計四條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫擴增，可在十幾分鐘到一小時之內產生10⁹-10¹⁰數量級的產物，反應結束后通過肉眼直接觀察體系狀態的改變來判定待測樣本的基因型，無需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可以有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水浴鍋即可開展檢測，又節約了大量的檢測成本。因此，采用LAMP方法檢測鐮刀形細胞性貧血癥是一種新的研究方向。

發明內容

本發明要解決的問題是現有的鐮刀形細胞性貧血癥檢測方法不理想，不適于大規模推廣使用。

為解決上述問題，本發明在LAMP的基礎上采用等位基因特異性環介導等溫擴增(Allele-SpecificLAMP)技術，針對編碼血紅蛋白的基因序列進行檢測，從而判斷待檢測人群是否攜帶可導致鐮刀形細胞性貧血癥的突變基因。本發明提供了一種適于推廣使用的鐮刀形細胞性貧血癥基因檢測引物及其組合物。

本發明的第一個目的在于提供一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測引物，用于檢測編碼血紅蛋白的基因序列，包括以下引物：

5′-GTCGACTGTTGCTTACACTTTC-3′(SEQIDNo.1，以下簡稱F3)

5′-GCCCAGTTTCCATTTGCCT-3′(SEQIDNo.2，以下簡稱B3)

5′-TCTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3′(SEQIDNo.3，以下簡稱FIPA)

5′-ACTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3′(SEQIDNo.4，以下簡稱FIPT)

5′-TGAACGTGGATGCAGTTGGTGGGAGCCTCTCTTATAACCTTGATACC-3′(SEQIDNo.5，以下簡稱BIP)。

本發明提供的引物中，針對編碼血紅蛋白β鏈的基因序列的野生型和突變型分別設計特異性引物FIPA和FIPT，在這兩個特異引物的特異堿基的附近均添加了一個新的突變，增加了引物的特異性，進一步減少非特異性的影響，提高了檢測的準確性。

本發明的第二個目的在于提供一種鐮刀形細胞性貧血癥的基因檢測組合物。所述組合物包括上述的引物，還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。

進一步地，所述組合物分為兩個體系，分別為檢測編碼血紅蛋白基因序列中A等位基因的體系A和檢測T等位基因的體系T；

體系A中包括F3、B3、FIPA、BIP、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水；

體系T中包括F3、B3、FIPT、BIP、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。

優選地，兩個體系中均還包括用于顯示體系顏色的指示劑。