[發(fā)明專利]用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510628184.0
• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN105331684A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設計）人: 高其康;李梅;樓兵干
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 黃平英

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及基因測序技術(shù)領域，具體涉及一種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽，用于超高通量基因測序。

背景技術(shù)

微生物群落多樣性是微生物生態(tài)學和環(huán)境學研究的重點之一。目前利用宏基因組研究微生物多樣性越來越受到科學家們的關注，但由于對于同一個樣本來說，宏基因組研究的結(jié)果中往往細菌的數(shù)量占大多數(shù)而使得真菌等微生物種類遠少于細菌。這對于某些領域的研究非常不利，如對釀酒過程中各個時期的微生物種群研究，真菌的作用遠高于細菌，對酒類品質(zhì)的影響較大。因此利用真菌獨特的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列為靶序列，用PCR擴增的方法從復雜樣本中富集真菌DNA成為非常有效的方法。

Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccesstothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J].1998,5(10):R245-R249.)等(1998)首次提出宏基因組的概念，其定義為“thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature”，即環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因組總和。本發(fā)明所指的宏內(nèi)間隔序列是指環(huán)境中全部真菌內(nèi)間隔序列的總和，為微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的提供了一條新的思路。

核糖體RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的變異速率，是目前在微生物分子生態(tài)學上應用最廣泛的分子標記。真核生物基因組中編碼核糖體RNA的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4種，它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔(匡治州,許楊.核糖體rDNAITS序列在真菌學研究中的應用[J].生命的化學,2004(02):120-122.)。其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，適合于較高等級水平的生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer，ITS)，包括18S和5.8S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)及5.8S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)兩部分，由于ITS不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性。同時ITS序列長度適中，從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長度為1000bp到小于300bp大小不等，人們可以從不太長的序列中獲得足夠的信息，可廣泛用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學研究(IwenPC,HinrichsSH,RuppME.Utilizationoftheinternaltranscribedspacerregionsasmoleculartargetstodetectandidentifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol,2002,40(1):87-109)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用，提高超高通量測序的樣本通量，有效降低超高通量測序成本，有效富集樣本中整個微生物種群中的真菌種群，為探明環(huán)境中真菌多樣性研究提供高通量分析途徑。

一種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽，其序列如如下序列編號NO.1～NO.48所示。

本發(fā)明復合標簽的每一條序列由左側(cè)8-10個堿基組成具唯一性標簽和右側(cè)21個源于真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列組成的標簽復合而成。

表1

本發(fā)明還提供一種真菌高通量基因測序方法，包括如下步驟：

(1)提取每一個樣本的總DNA；

(2)對每一個樣本，從權(quán)利要求1中所示48對且未被選擇過的序列中選擇任一一對序列作為引物，對對應樣本的總DNA進行擴增；

(3)對每一個樣本的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，對擴增產(chǎn)物進行純化回收；

(4)對每個樣本純化回收后的產(chǎn)物紫外分光光度計精確定量；

(5)將所有樣本等量混合后建立一個測序文庫；

(6)對所建測序文庫進行高通量測序。