[發明專利]一種人重組Irisin蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510628165.8
• 申請日: 2015-09-29
• 公開（公告）號: CN105200061A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 顧志良;何賽;郁建鋒;金澤楷;張燕萍
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/17;A61P3/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

技術領域

本發明涉及基因工程領域中重組基因的可溶性表達和純化方法，特別涉及人Irisin蛋白的原核表達和純化方法。

背景技術

Irisin是2012年年初由Spiegelman實驗室在《自然》雜志上報道的一種新的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5(fibronectintypeⅢdomain-containingprotein5，FNDC5)后形成的可分泌多肽片段。人FNDC5的N-端有一個信號序列，中間為Ⅲ型纖連蛋白結構域(FND)，緊接其后的為疏水氨基酸區和C-末端。Irisin是FNDC5中纖連蛋白結構域的主要部分，是由112個氨基酸殘基組成的N-糖基化蛋白質激素，其序列在種屬間高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性為100％。

發現者用希臘神話中信使女神Iris的名字為Irisin命名，暗喻其像Iris一樣，作為骨骼肌的使者，傳遞骨骼肌的信號，并連接骨骼肌與外周組織的關系。Irisin最重要的生物學功能是通過內分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪細胞，使后者轉變為具有分解代謝脂肪特征的棕色脂肪細胞，以產熱的方式消除白色脂肪，從而起到減肥作用。研究表明，鳶尾素水平主要反映了肌肉質量，且在年輕的男性運動員中其量高于老年女性；另有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且與新發II型糖尿病的發病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中發揮關鍵作用；此外，有關報道還指出Irisin與非酒精性脂肪肝、心率衰竭等病理現象存在一定的相關性。

可以看出Irisin必將是一個很有前景的活性因子，并成為代謝性疾病及其并發癥防治的新靶點，有非常大的潛在價值。因此，開發Irisin蛋白的可大規模生產并便于純化的方法，具有非常大的價值。

發明內容

發明目的：本發明的第一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列。

本發明的另一個目的在于提供一種人Irisin重組蛋白。

本發明的又一個目的是提供含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌。

本發明的又一個目的是提供一種轉基因重組菌。

本發明的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的制備方法。

本發明的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應用。

技術方案：為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQIDNO：1所示。

一種人Irisin重組蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌。

將所述的DNA序列插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達人Irisin重組蛋白的DNA的重組表達載體。

其中，所述大腸桿菌表達載體為pET-30a(+)。

一種轉基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選得到轉基因重組菌。

所述的DNA序列、重組表達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌在生產人Irisin重組蛋白中的應用。

一種人Irisin重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1)從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉錄PCR得到其cDNA，以cDNA為模板，PCR得到人Irisin的基因片段，其堿基序列如SEQIDNO：1所示；

2)構建pET30a-Irisin原核表達載體；

3)構建Rosetta-pET-30a-Irisin原核表達菌株；

4)人Irisin重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定。

一種所述的人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應用。

有益效果：本發明相對于現有技術，具有以下優點：本發明所提供的方法步驟簡便，生產成本低，生產周期短，通過本發明所提供的方法，可得到純度較高的特異性目的蛋白。其最主要優勢在于：本發明首次以原核表達體系實現了人Irisin蛋白的可溶性表達，并且，在用鎳柱純化蛋白的過程中通過咪唑梯度洗脫及pH梯度洗脫，確定了目的蛋白的最佳洗脫條件，可得到高純度的目的蛋白。

附圖說明