[發(fā)明專利]鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510625207.2
• 申請(qǐng)日: 2015-09-28
• 公開（公告）號(hào): CN105087607A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫濤;鄧明俊;王超;房保海;徐彪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12N15/40
• 分類號(hào): C12N15/40;C12N15/70;C07K14/18;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 劉帥帥

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達(dá)的方法及其應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鴨源坦布蘇病毒病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）屬黃病毒科黃病毒屬成員，是引起國(guó)內(nèi)以卵巢炎為特征的水禽新發(fā)傳染性疾病的主要病原，該病流行廣泛、傳播迅速、自2010年首次報(bào)道以來(lái)，病毒已在產(chǎn)蛋鴨、肉鴨和鵝等養(yǎng)殖水禽上發(fā)生感染，并造成產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降等經(jīng)濟(jì)損失。

DTMUV病毒編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。其中囊膜糖蛋白（envelopeprotein,簡(jiǎn)稱E蛋白）是坦布蘇病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于成熟病毒粒子表面，構(gòu)成病毒顆粒的突起，在靶細(xì)胞受體結(jié)合，膜融合和病毒侵入過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。具備較好的免疫原性和反應(yīng)原性，是宿主抗感染免疫的主要保護(hù)性抗原，也是檢測(cè)該病毒特異性抗體的理想靶抗原。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達(dá)的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)的方法，包括下列步驟：

（1）特異性引物引物設(shè)計(jì)與合成：

DTMUV-BamHⅠ-F(上游引物)P1：

5’—GGATCCCTAGTGAAGAATCCTACCG—3’黑體部分為添加的BamHⅠ酶切位點(diǎn)；

DTMUV-EcoRⅠ-R(下游引物)P2：

5’—AAGTGAATTCACCCCCAACTGAGCC—3’黑體部分為添加的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；

（2）鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的克隆測(cè)序

（3）鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的克隆表達(dá)

（4）重組質(zhì)粒pET-28a-EM的表達(dá)與純化

所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白的第三結(jié)構(gòu)域的克隆測(cè)序是：

病毒RNA的提取按照病毒總RNA提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，RT-PCR反應(yīng)體系按照PrimeScript^?OneStepRT-PCRKit說(shuō)明進(jìn)行操作，反應(yīng)程序：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳條帶，膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物送往大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的克隆表達(dá)是：

以DTMUV-QD株病毒RNA為模板，E基因第三結(jié)構(gòu)域的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行操作，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EM，并通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定及序列分析。

所述的第三結(jié)構(gòu)域重組質(zhì)粒pET-28a-EM的表達(dá)與純化是：

重組質(zhì)粒pET-28a-EM轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單個(gè)菌落至2×YT培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1：100進(jìn)行轉(zhuǎn)種2×YT培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)，用終濃度為0.1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

將表達(dá)菌離心后加入PBS重懸菌體，超聲波冰浴裂解，離心處理后的進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，通過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化重組E蛋白。

本發(fā)明的方法中表達(dá)的鴨坦布蘇病毒E蛋白可用于檢測(cè)鴨坦布蘇病毒和制備鴨坦布蘇病毒抗體。

本發(fā)明的有益效果：

坦布蘇病毒是在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的對(duì)水禽致病的新型黃病毒，傳播迅速、對(duì)鴨鵝危害大，已給中國(guó)水禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由于坦布蘇病毒在中國(guó)爆發(fā)時(shí)間短，所以在該病毒的致病機(jī)理、跨物種傳播機(jī)制及疫苗研制方面還存在很多迫切需要解決的難題。E蛋白是黃病毒的囊膜蛋白，也是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)研究結(jié)果表明，E蛋白是體外中和作用的主要靶點(diǎn)和病毒特異性抗體的作用位點(diǎn)，具有中和活性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體引發(fā)特異性免疫。對(duì)E蛋白進(jìn)行X射線晶體研究表明：第3結(jié)構(gòu)域具備類免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，包含病毒結(jié)合受體。具備組成主要線性表位的區(qū)域，也包含病毒中和單抗的識(shí)別位點(diǎn)。