[發明專利]鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域原核表達的方法及其應用

在審

• 申請號: 201510625207.2
• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN105087607A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 孫濤;鄧明俊;王超;房保海;徐彪
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/70;C07K14/18;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉帥帥

1.鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域原核表達的方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）特異性引物引物設計與合成：

DTMUV-BamHⅠ-F(上游引物)P1：

5’—GGATCCCTAGTGAAGAATCCTACCG—3’黑體部分為添加的BamHⅠ酶切位點；

DTMUV-EcoRⅠ-R(下游引物)P2：

5’—AAGTGAATTCACCCCCAACTGAGCC—3’黑體部分為添加的EcoRⅠ酶切位點；

（2）鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆測序；

（3）鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆表達；

（4）第三結構域重組質粒pET-28a-EM的表達與純化。

2.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達的方法，其特征在于，

所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域的克隆測序是：

病毒RNA的提取按照病毒總RNA提取試劑盒的說明進行操作，RT-PCR反應體系按照PrimeScript^?OneStepRT-PCRKit說明進行操作，反應程序：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個循環；72℃10min；

反應結束后0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳條帶，膠回收試劑盒回收純化PCR產物；

將回收的PCR產物送往大連寶生物工程有限公司進行測序鑒定。

3.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結構域原核表達的方法，其特征在于，

所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白的克隆表達是：

以DTMUV-QD株病毒RNA為模板，E基因的特異性引物進行RT-PCR擴增，連接轉化按照《分子克隆實驗指南》進行操作，構建第三結構域重組表達質粒，命名為pET-28a-EM，并通過BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定及序列分析。

4.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白原核表達的方法，其特征在于

所述的重組質粒pET-28a-EM的表達與純化是：

重組質粒pET-28a-EM轉化至大腸桿菌BL21(Rosetta)感受態細胞，37℃過夜培養，挑選單個菌落至2×YT培養基中，37℃震蕩培養過夜，按1：100進行轉種2×YT培養基中，37℃振搖培養，用終濃度為0.1mM的IPTG進行誘導表達；

將表達菌離心后加入PBS重懸菌體，超聲波冰浴裂解，離心處理后的進行SDS-PAGE鑒定，通過Ni-NTA親和層析柱純化重組E蛋白。

5.上述任一項權利要求所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白在檢測鴨坦布蘇病毒上的應用。

6.上述任一項權利要求所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白在制備鴨坦布蘇病毒抗體上的應用。