[發明專利]基因工程菊粉酶及其以菊芋為原料制備結晶果糖的方法

有效

• 申請號: 201510618315.7
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105087519B
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 田康明;王君;王正祥
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N1/19;C12N1/21;C12N1/15;C12N15/77;C12N15/75;C12N15/74;C12N15/80;C12P19/14
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明涉及酶的基因工程技術領域，具體涉及由基因工程重組菊粉酶I和菊粉酶II復配獲得的復合酶制劑，及其用于以菊芋為原料制造高品質結晶果糖的技術。本發明通過將菊粉酶I和菊粉酶II以三種方式串聯表達，再通過將三種重組酶合理的復配獲得復合酶制劑。同時，建立了菊芋為原料生產高品質結晶果糖的酶解工藝，克服了單一菊粉酶作用時間長，效率低，或不能最終形成高含量的單一果糖的缺點，迅速高效的形成含量高達96％以上的果糖，再通過葡萄糖氧化酶和Ca²⁺將葡萄糖去除，得到100％結晶果糖。該工藝簡單，節約經濟成本，是一種生產結晶果糖的新工藝。采用本發明方法得到的結晶果糖產品，可廣泛應用于醫藥、食品、飼料等重要領域。

技術領域

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及一種基因工程菊粉酶的復合酶制劑的高效制備方法及其用于以菊芋為原料制造高品質結晶果糖的技術。

背景技術

果糖是葡萄糖的同分異構體，是糖類中化學活性最高的糖，但其甜度為蔗糖的1.8倍(葡萄糖甜度為蔗糖的0.8倍左右)，在人體內的代謝比葡萄糖快，容易被機體吸收，且不依賴胰島素，對血糖影響很小，適用于葡萄糖代謝及肝功能不全的患者補充能量，同時它還具有促進益生菌繁殖，改善腸功能和代謝，不致齲齒等特性。因其具有低熱量性，不引起血糖升高，不刺激胰島素分泌，與脂肪同食，可抑制人體脂肪的過量儲存，以及抑制齲齒，促進鈣的吸收等特性成果了高端食用糖產品，可廣泛應用于各類食品及醫藥保健品中。尤其是結晶果糖，是糖尿病、心血管和肝臟病人良好的營養甜味品。

目前國內市場上的果糖產品，主要以果葡糖漿等形式存在，高純度的結晶果糖由于技術限制，價格較高，產量相對較少。近年來，大量的臨床科學研究的證實，高純度的結晶果糖在人體代謝上有著獨特的功效。但結晶果糖作為一種重要的營養甜味劑，難以用于各種食品配方中，原因是價格昂貴。其原因是我國果糖工業化生產技術尤其是結晶果糖生產技術較落后，生產規模不大，在我國才剛剛起步。

菊粉(Inulin)又稱菊糖，主要來源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子經β-2,1糖苷鍵脫水聚合而成的線性直鏈多糖，其還原端含有一個葡萄糖殘基，呈直鏈結構，聚合度通常在2～60，分子量為3000～5000碳單位，是一種功能性果聚糖和水溶性膳食纖維。菊粉作為一種純天然的功能性食品配料，已被世界20多個國家批準為營養增補劑，廣泛運用于乳制品、飲料、低脂低熱量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中國衛生部批準菊粉為新資源食品。

目前報道產菊粉酶的微生物包括魯維酵母屬、海洋酵母屬、青霉屬、曲霉屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、節桿菌屬、放線菌屬等，其中產菊粉酶的微生物主要集中在酵母菌屬、青霉屬和曲霉屬。但是通過野生型篩選、理化誘變和工藝條件優化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途徑之一。利用生物信息學技術獲得菊粉酶基因inuI和inuII的結構和氨基酸序列，將其高效表達于基因工程酵母菌中，實現菊粉酶的高效表達。

目前結晶果糖在工業上的生產方法按原料來源有三種：(1)以蔗糖為原料，經過水解得到果葡糖液(其中果糖含量為46％～50％)，經色譜分離，將果糖和葡萄糖分開，得到高純度的果糖液(果糖含量90％以上)，將高純果糖經過離子交換和濃縮結晶，得到結晶果糖。(2)以玉米淀粉生成葡萄糖為原料，通過葡萄糖異構酶進行異構化反應，得到果葡糖液(其中果糖含量為42％左右)，經色譜分離，將果糖和葡萄糖分開，得到高純度的果糖液(果糖含量90％以上)，再將高純度果糖液經過離子交換和濃縮結晶，得到結晶果糖。(3)以菊糖為原料，將菊糖經過水解得到100％果糖液，將果糖液經過離子交換濃縮結晶，得到結晶果糖。前兩種生產方法實質上很相似，但是結晶果糖產率都很低，一般為葡萄糖或蔗糖投料量的20％～26％，生產結晶果糖后的大量葡萄糖組分及果糖母液無法得到有效的利用，造成生產成本高。故采用第三種方法可以提高高價值結晶果糖產品的產率，從而大幅提高經濟效益，是目前果糖生產工藝研究、開發和改革的主要內容，對促進我國結晶果糖研究和國民經濟發展具有重要的意義。

發明內容