[發明專利]基因工程菊粉酶及其以菊芋為原料制備結晶果糖的方法

有效

• 申請號: 201510618315.7
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105087519B
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 田康明;王君;王正祥
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N1/19;C12N1/21;C12N1/15;C12N15/77;C12N15/75;C12N15/74;C12N15/80;C12P19/14
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

1.一種重組基因工程菌，其特征在于，所述重組菌包含核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的菊粉酶基因inuI和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的菊粉酶基因inuII，以及上述基因在同一宿主細胞中的串聯表達；

所述重組菌是以畢赤酵母菌GS115為宿主細胞以質粒pPIC9K為表達載體的

a：優先表達菊粉酶I的重組酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII，

或b：優先表達菊粉酶II的重組酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI，

或c：無序表達菊粉酶I和菊粉酶II的重組酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

2.權利要求1所述重組基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)從黑曲霉中克隆得到兩個菊粉酶基因inuI和inuII，分別與質粒pPIC9K進行酶切連接得到重組質粒pPIC9K-inuI和pPIC9K-inuII；

(2)以重組質粒pPIC9K-inuII為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物進行PCR擴增，得到的DNA片段與重組質粒pPIC9K-inuI進行酶切、連接，構建重組質粒pPIC9K-inuI-inuII，重組質粒pPIC9K-inuI-inuII用Sal I進行單酶切線性化，酶切產物經純化回收后電擊轉化入畢赤酵母獲得重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI-inuII；

(3)以重組質粒pPIC9K-inuI為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的引物進行PCR擴增，得到的DNA片段與重組質粒pPIC9K-inuII進行酶切、連接，構建重組質粒pPIC9K-inuII-inuI，重組質粒pPIC9K-inuII-inuI用Sal I進行單酶切線性化，酶切產物經純化回收后電擊轉化入畢赤酵母獲得重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuII-inuI；

(4)以重組質粒pPIC9K-inuII為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8所示的引物進行PCR擴增，得到的DNA片段與重組質粒pPIC9K-inuI進行酶切、連接，構建重組質粒pPIC9K-inuI/inuII，重組質粒pPIC9K-inuI/inuII用Sal I進行單酶切線性化，酶切產物經純化回收后電擊轉化入畢赤酵母獲得重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K-inuI/inuII。

3.權利要求1所述重組菌在發酵生產菊粉酶中的應用。

4.利用權利要求1所述重組菌發酵生產菊粉酶的方法，其特征在于，發酵培養基組成：85％磷酸2.67mL/L，硫酸鈣1.18g/L，硫酸鉀18.2g/L，硫酸鎂7.27g/L，氫氧化鉀4.13g/L，50％甘油40.0g/L，其余為水；發酵溫度為30℃，pH維持5.0，DO維持20％以上；甘油耗盡后，DO會快速上升，進入補料生長階段：流加50％甘油，初始流加速度為3.0～9.0mL/min，當DO低于20％時停止流加；待甘油再次耗盡，DO快速上升后，使菌體保持饑餓狀態1h，然后進入誘導產酶階段：流加甲醇，初始流加速率為1.2～3.6mL/min，當DO低于20％時停止流加；待甲醇耗盡，DO快速上升后，重新開始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min，2h后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min，誘導70～96h后發酵結束。

5.一種復合酶，由權利要求1所述a、b、c三種重組菌中的兩種菌所生產的重組菊粉酶按照酶活比為1-10:10-1復配而成。

6.如權利要求5所述的復合酶，其特征在于，所述復合酶為權利要求1所述a、c兩種重組菌生產的重組菊粉酶以酶活比為1:1復配而成。

7.權利要求5所述復合酶在催化菊芋生產結晶果糖中的應用。

8.利用權利要求5所述復合酶催化菊芋生產結晶果糖的方法，包括步驟如下：將菊芋經過干燥粉碎、打漿、水浴浸提、除雜脫色得到浸提液，調節pH 5～7，按每kg菊芋添加權利要求5所述復合酶總酶活1900000U，控制溫度在60～80℃，攪拌速度在50～200r/min的條件下反應4～12h，當寡聚糖全部酶解為單糖時，停止反應，進一步按水解液中的每kg葡萄糖添加8000U的葡萄糖氧化酶，再加入葡萄糖當量的Ca²⁺，沉淀去除葡萄糖，再將水解物進行濃縮，結晶即為100％結晶果糖產品。