[發明專利]一種GII.17型諾如病毒基因組擴增引物和擴增方法

有效

• 申請號: 201510617459.0
• 申請日: 2015-09-23
• 公開（公告）號: CN105176984B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 薛亮;吳清平;蔡偉程;蔡淑珍;張菊梅
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種GII.17型諾如病毒基因組擴增引物和擴增方法。本發明分別以七對引物作為擴增引物的上下游引物，以GII.17型諾如病毒的RNA為模板進行RT?PCR擴增，分別得到擴增產物，然后對擴增產物進行核酸序列測序，然后再拼接比對，得到GII.17型諾如病毒基因組全長序列。本發明針對新出現的GII.17型諾如病毒流行基因型，根據基因組所包含的三個開放閱讀框設計了“4+1+1”的分段擴增策略，根據保守區域設計相應的擴增引物，將該擴增引物應用于實際檢出樣本，獲得了GII.17型諾如病毒基因組序列。本發明方法具有操作簡單、周期短、成本低以及靈敏度高的特點，可廣泛應用于醫療衛生、檢驗檢疫等具有諾如病毒檢測需求及相應的科研領域。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種GII.17型諾如病毒基因組擴增引物和擴增方法。

背景技術

諾如病毒(Norovirus)是全球散發性與流行性胃腸炎的重要食源性病原之一。NoV的危害主要在于其極強的傳播能力，美國疾病控制中心已于2006年將其列為生物恐怖B類因子。該病毒可感染各年齡段人群，主要臨床表現為嘔吐、腹瀉、發熱等，對兒童、老人及免疫缺陷人群還易造成脫水性死亡。據報道，諾如病毒每年至少造成2.3億人次的感染，在發展中國家更是導致20萬例以上5歲以下兒童的死亡，對公共衛生安全造成了極大的威脅。至目前為止，還沒有有效的抗病毒藥物及治療手段。

作為RNA病毒，諾如病毒具有豐富的遺傳多樣性，根據其衣殼蛋白序列同源性可將病毒分成GI-GVI的6個基因組(Genogroup)，而GI、GII和GIV可感染人類。每個基因組又可進一步分成不同的基因型(Genotype)，例如GI含有9個基因型，GII含有23個(并不斷增加)。其中，GII.4型被報道是全球近二十年來的主要流行基因型，約80％的諾如病毒感染是由這種型別的毒株引起的，并且該病毒每隔兩三年就會產生一種新的變異株，同時造成一輪大范圍的病毒流行。然而引起注意的是，2014年底在中國、日本、韓國等地暴發了多起由一種新型GII.17諾如病毒流行株引起的胃腸炎疫情，同時散發性病例中也證實了該型別毒株的廣泛存在。有學者提出了疑問，是否這種新型別毒株將替代已流行近二十年的GII.4型呢？因此，充分積累GII.17型毒株的基因組信息，掌握其自身變異特點以及與原流行株GII.4的差異，將對這種新流行株的預防與控制具有重要意義。

諾如病毒基因組長約7.5-7.8kb，包括3個開放閱讀框。目前報道的基因組擴增方法有直接擴增法以及分段擴增法，其中我們前期工作中針對GII.4型諾如病毒建立的“4+1+1”擴增策略具有操作簡單、周期短、成本低以及靈敏度高的特點。而對于新流行基因型GII.17，目前還未有關于其擴增方法的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種高靈敏度的GII.17型諾如病毒基因組擴增引物和擴增方法。

本發明的GII.17型諾如病毒基因組擴增引物，其特征在于，包括七對擴增引物：

引物對1：II-P1F：5'-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；

II.17-1R：5'-GCAACTTTCTTGGCTAGCTC-3'；

引物對2：II.17-2F：5'-CATACATGAGGACTCTTGAC-3'；

II.17-2R：5'-CTTAGCAATGGCAAGCTC-3'；

引物對3：II.17-3F：5'-CAGGGATGAAGATGACCTCAC-3'；

II.17-3R：5'-GAGACCACCAAATGCTCTG-3'；

引物對4：II.17-4F：5'-CCTCGACAAGACAACCTCC-3'；

G2SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；