[發明專利]誘導多能干細胞體外定向分化成晶狀體小體的方法

有效

• 申請號: 201510617265.0
• 申請日: 2015-09-25
• 公開（公告）號: CN105238737B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 姚克;傅秋黎;秦禎蔚
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新;王之懷

本發明涉及新型誘導多能干細胞體外定向分化成晶狀體小體的方法。目的是提供的方法應能形成形態良好且具備光學功能的晶狀體小體；獲得的晶狀體小體可用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。技術方案是：新型誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，包括以下步驟：(1)將多能干細胞定向誘導分化成初級神經外胚層細胞團；(2)分離挑選初級神經外胚層細胞團；(3)誘導神經外胚層細胞定向分化為初級晶狀體小體；(4)誘導初級晶狀體小體分化為成熟的晶狀體小體。所述方法獲得的晶狀體小體，用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。

技術領域

本發明涉及細胞生物學技術領域，具體是一種體外誘導晶狀體小體的制備方法。

背景技術

多能干細胞（pluripotent stem cells）包括胚胎干細胞（ESCs）和誘導性多能干細胞（iPSCs）兩類，是具有多分化潛能的細胞，理論上來說可以分化成任意一類細胞，將多能干細胞注射到免疫抑制的小鼠內可形成具有內中外三個胚層的畸胎瘤。

多能干細胞在藥物研究、疾病機制研究及再生移植領域都有非常重要的作用。國內外已有學者利用多能干細胞定向誘導分化成特定的細胞或組織前體，作為藥物毒性篩選原料，成為臨床試驗的第一步。在再生醫學領域，國內外學者甚至已成功利用多能干細胞技術聯合體外定向分化以及體內注射等手段在視網膜退行性病變、角膜病變、肝臟損害、心肌損害等多種疾病上實現了再生移植治療。為疾病的機制研究和治療提供了新的思路。

先天性白內障是造成兒童失明和視力損害的重要原因，任何直接或間接參與、影響晶狀體發育的基因突變都可能導致先天性白內障的發生。因此，明確先天性白內障的發病機制對于治療及預防先天性白內障的發生發展具有重要的意義。將多能干細胞中的iPSCs技術和體外晶狀體誘導技術結合，可以獲得先天性白內障患者特異性的多能干細胞及晶狀體，國際上將體外形成的晶狀體稱之為晶狀體小體，通過觀察和檢測晶狀體小體發生發展過程中各類基因、蛋白的表達變化可以更直觀的描述其發病過程，為發病機制的研究提供更有力的證據，同時也為基因治療提供了理論基礎。

年齡相關性白內障為全球首位致盲眼病之一，目前尚無預防及早期治療的有效的藥物，而相關有效研究模型的缺乏是藥物研究面臨的最大障礙，如現有細胞模型無法在藥物釋放、作用以及跟體內微環境互相作用等方面無法真實反映藥物在體內的作用情況；而動物模型則與人體之間存在不可避免的種族差異，因此很難構建合適的藥物篩選模型。白內障摘除聯合人工晶體植入術是治療白內障最常用且迄今為止效果較為理想的方法，但人工晶體存在的局限性以及術后后囊膜混濁的發生均在一定程度上影響了患者的視覺質量，限制了人工晶體的進一步發展。總結來言，白內障作為全球首位的致盲性眼病，其發病機制、疾病預防及早期治療、再生晶體的研究及運用由于有效模型的缺乏而停滯不前。

目前國內外已有研究小組在動物實驗中通過將晶狀體囊袋放置在房水中培養獲得有初步晶狀體結構的小體，但由于材料來源的限制而無法過渡到人晶狀體上。在人晶狀體發育研究中，有研究團隊實現了在體外誘導胚胎干細胞定向分化成晶狀體上皮細胞及晶狀體纖維細胞，這個定向分化的過程部分再現了晶狀體的發育過程，但其應用都由于無法形成形態良好具備光學功能的晶狀體小體而受到限制。

發明內容

本發明的目的是克服上述背景技術中的不足，提供一種誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法及應用，該方法應能形成形態良好且具備光學功能的晶狀體小體；獲得的晶狀體小體可用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。

本發明提供技術方案是：

誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，包括以下步驟：

（1）將多能干細胞定向誘導分化成初級神經外胚層細胞團