[發明專利]誘導多能干細胞體外定向分化成晶狀體小體的方法

有效

• 申請號: 201510617265.0
• 申請日: 2015-09-25
• 公開（公告）號: CN105238737B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 姚克;傅秋黎;秦禎蔚
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新;王之懷

1.一種誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，包括以下步驟：

（1）將多能干細胞定向誘導分化成初級神經外胚層細胞團

將多能干細胞接種到基質膠溶液包被的六孔板上，用含人生長因子noggin的mTesR培養液培養5-7天后形成初級神經外胚層細胞團；所述基質膠溶液由胚胎干細胞基質膠溶解在DMEM/F12培養液后形成, 胚胎干細胞基質膠的體積比例為0.8-1.2%；

（2）分離挑選初級神經外胚層細胞團

用乙二胺四乙酸溶液消化初級神經外胚層細胞團，然后用機械法將初級神經外胚層細胞團周邊的數層神經外胚層細胞挑出；

（3）誘導神經外胚層細胞定向分化為初級晶狀體小體

將挑出的神經外胚層細胞團接種到新的基質膠溶液包被的六孔板中，用含人生長因子bFGF、BMP4、BMP7的mTesR培養液培養5-7天并且每日更換培養液，保留出現“荷包蛋樣”細胞排列結構的神經外胚層細胞團，其余細胞團剔除，繼續培養8-10天后即可獲得初級晶狀體小體；所述新的基質膠溶液由胚胎干細胞基質膠溶解在DMEM/F12培養液后形成，胚胎干細胞基質膠的體積比例為0.8-1.2%；

（4）誘導初級晶狀體小體分化為成熟的晶狀體小體

用含人生長因子bFGF、Wnt3a的mTesR培養液培養初級晶狀體小體，并且每日更換mTesR培養液，9-11天后即可獲得由囊膜、晶狀體上皮細胞、晶狀體初級纖維細胞及晶狀體成熟纖維細胞構成的晶狀體小體；

所述步驟（1）中，mTesR培養液中含有90-110ng/ml的人生長因子noggin；

所述步驟（2）中挑出的神經外胚層細胞團為5-10層的內層細胞、3-7層的中層細胞以及3-7層的外層細胞；

所述步驟（3）“荷包蛋樣”細胞排列結構的神經外胚層細胞團，其結構為外層數十層分化的上皮樣細胞，細胞體積較中央區細胞明顯增大，胞質多，細胞排列相對疏松，中央區細胞體積小排列緊湊，胞質少，兩類細胞相接形成類似荷包蛋的結構；該“荷包蛋樣” 的中央區細胞團較厚、周邊為相連的裙邊狀。

2.根據權利要求1所述的誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量為0.4-0.6mM，并且加入氯化鈉使乙二胺四乙酸溶液的滲透壓為320-360mOsm。

3.根據權利要求2所述的誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，其特征在于：所述步驟（3）中，mTesR培養液中含有17-23ng/ml的BMP4、17-23ng/ml 的BMP7、80-120ng/ml的bFGF；所述步驟（4）中，mTesR培養液中含有17-23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml的bFGF。

4.根據權利要求3所述的誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，其特征在于所述的晶狀體小體呈現透明的3D結構，為圓形或橢圓形，直徑1-3mm，表達晶狀體特異性蛋白包括α-A、α-B、β、γ四種晶狀體蛋白以及水通道蛋白MIP。

5.根據權利要求4所述的誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，其特征在于所述的α-A、α-B、β、γ四種晶狀體蛋白為晶狀體纖維細胞的結構蛋白，水通道蛋白MIP為表達在晶狀體上皮細胞以及晶狀體纖維細胞細胞膜上的通道蛋白。

6.根據權利要求5所述的誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，其特征在于所述的囊膜為晶狀體外層包繞的一層透明薄膜，晶狀體上皮細胞為囊膜下的僅有的一層柱狀或立方狀上皮細胞，初級晶狀體纖維細胞為部分細胞器細胞核開始退化的由晶狀體上皮細胞分化而來的纖維細胞，成熟晶狀體纖維細胞為胞內細胞器細胞核完全退化由初級晶狀體纖維細胞分化而來的細胞。

7.權利要求1所述方法獲得的晶狀體小體，用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。