[發明專利]一種昆蟲細胞表達抗菌肽Cecropin DC1的方法

有效

• 申請號: 201510616121.3
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105200084A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 黃自然;陳松彬;倪彥燕
• 申請（專利權）人: 廣州市科瑋生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K14/435;C12N15/12
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 陳雅平

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法。

背景技術

抗菌肽是一類具有生物活性的小分子堿性多肽，具有殺菌力強、抗菌譜廣、穩定性好及不產生耐藥性等優點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒作用，僅作用于原核細胞及發生病變的真核細胞。

現有技術查閱發現中國專利ZL200510032743.8公布了一種抗菌肽DC及其制備方法與應用，根據天然抗菌肽的序列，設計、合成抗菌肽DC基因，選擇酵母偏愛的遺傳密碼子，轉化穿梭質粒，轉入季也蒙念球菌中表達。但目的基因DC在季也蒙念球菌中的表達量受到限制、質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失等缺點。

發明內容

本發明的目的是在于提供一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，利用基因工程，構建含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒，并利用Sf21細胞作為宿主，表達生產具有生物活性的重組抗菌肽CecropinDC1。

本發明通過以下技術方案來實現：

1、一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1，通過點突變技術，將第38位賴氨酸的密碼子AAG改為天冬酰胺的密碼子AAC。此處氨基酸密碼子的改變對表達產物的殺菌活性明顯的提高。

2、所述的昆蟲細胞表達CecropinDC1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3、一種昆蟲細胞表達CecropinDC1的重組核苷酸序列，包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

4、一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，包括以下步驟：

1）構建包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重組桿狀病毒轉移載體。

2）將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽Cecropin的重組病毒。

在1.5ml滅菌的Eppendorf管中加入2μg重組轉移載體DNA、10μgAcNPV-DNA及0.8ml共轉染緩沖液，將該混合物在室溫下孵育30min后共轉染對數期的Sf21昆蟲細胞；然后將共轉染后的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基清洗兩次，再用含有10%FBS的完全培養基在27℃下培養4~6d，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒。

3）重組病毒感染旺盛生長的Sf21細胞，27℃培養4~6d進行感染表達，之后通過離心收集培養液。

與現有技術相比，本發明具有的有益效果是：

1、抗菌肽CecropinDC1是一個經過修飾改進的基因。將第38位的賴氨酸改為天冬酰胺，這種氨基酸密碼子的改變使其具有較高的殺菌效價，特別是對多種病原微生物有較好的抑菌作用，如大腸桿菌、金黃葡萄球菌等。

2、本發明解決了抗菌肽CecropinDC1在季也蒙念球菌表達中質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失和在哺乳動物細胞生產成本太高等缺點，獲得的Sf21細胞表達重組抗菌肽CecropinDC1具有較高的生物活性，且大部分被分泌到培養基中，有利于蛋白的快速提取純化。本發明的抗菌肽CecropinDC1可以大量生產，并且為抗菌肽CecropinDC1在醫學、食品和化妝品上的應用開辟了廣闊的前景。

附圖說明

圖1是抗菌肽CecropinDC1的PCR擴增產物；

1：目的基因PCR產物，M：Marker。

圖2是本發明抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定量測定；

1：抗菌肽CecropinDC1發酵液，2：抗菌肽DC發酵液，3：無菌水。

圖3是本發明抗菌肽抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定性測定；

CK^—：無菌水，CK⁺：Amp，1：抗菌肽DC，2：抗菌肽CecropinDC1。

具體實施方式

以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。

實施例1

抗菌肽CecropinDC1基因的克隆

根據抗菌肽CecropinDC1基因改造和克隆的需要,利用Primerpremier5.0軟件設計、合成引物：

P1：5’ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3’；