[發明專利]人PON1基因rs854560位點多態性檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510615081.0
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105331682A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 劉素香;李磊;李海娟;李露;宋新魁;李曉輝;張育紅;劉偉俊;歐海燕
• 申請（專利權）人: 鄭州市職業病防治院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙) 11512
• 代理人: 張群峰;呂良

技術領域

本發明涉及測定單核苷酸多態性的方法。

背景技術

SNP(單核苷酸多態性)是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B性是個體與生俱來的遺傳特征，不隨環境發生變化，也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現，因此其應用并不存在診斷和治療作用。

基因多態性檢測在遺傳學領域和醫學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起源和進化等遺傳學現象。根據基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史，闡明物種進化關系。應用于考古學中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關系。2.研究多態與種群親緣關系等遺傳學研究。多態亦與各種人體特征密切相關，包括身高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫學領域可以用于疾病預防措施。通過研究人體對毒物的耐受性，發現易于對某種毒物發生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸，保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態檢測，篩查出容易出現血液毒性、神經毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物侵害。4.藥理學中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態檢測可以判斷患病個體對某種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。

對氧磷酶(paraoxonase,PON)基因家族包括三個成員：PON1、PON2和PON3。其中PON1基因位于染色體7q21.3，其表達的蛋白質能水解對氮磷類有機磷化合物和高密度脂蛋白上的氧化型磷脂。PON1基因rs854560位點多態，在人群中存在兩種等位基因A和T，形成三種PON1基因的基因型：AA型(人體基因組rs854560多態位點的兩個等位基因堿基均為A)，AT型(人體基因組rs854560多態位點的兩個等位基因堿基分別為A和T)和TT型(人體基因組rs854560多態位點的兩個等位基因堿基均為T)。

聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(PCR—RFLP)技術是一種快速、簡便、準確、低成本測定SNP(單核苷酸多態性)基因型的經典方法。該方法通過引物來對模板進行擴增反應，形成足夠數量和穩定的擴增產物，通過對擴增產物的酶切和檢測酶切產物的片段長度，最終測定出SNP。PON1基因rs854560多態位點采取PCR—RFLP技術進行檢測，所需內切酶為FatI，CviAII，NlaIII等，其價格較昂貴，因此需要開發新的檢測技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人PON1基因rs854560位點多態性的可靠手段。

根據本發明的第一方面，提供了一種測定人PON1基因rs854560位點多態性的方法，包括：

提供待測人基因組DNA；

提供擴增人PON1基因rs854560位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有錯配堿基C；

以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應以獲得含CCXTGG片段的擴增產物，其中X(T或A)為人PON1基因rs854560位點上待定堿基W(A或T)的互補堿基；

提供限制性內切酶；

利用限制性內切酶對所得擴增產物進行酶切(反應)以獲得相應的酶切產物；以及

根據所得酶切產物來確定人PON1基因rs854560位點上的待定堿基W是A還是T，

其中，限制性內切酶為僅能夠切開CCATGG片段與CCTTGG片段之一的限制性內切酶。

根據本發明的實施例，在所得擴增產物上，上游引物的錯配堿基C與多態堿基W的互補堿基X之間相隔一個堿基C。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現酶切不充分等現象。并且，如此設置上游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈敏度和特異度，這可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。

在本發明的具體實施例中，在所得擴增產物上，上游引物末端堿基與W相鄰。例如，下游引物末端可以是……CC等結構。

在本發明的一個優選實施例中，限制性內切酶可以采用僅能切開CCATGG片段的NcoI或其同裂酶。這類NcoI酶價格低廉，能大大降低測定成本。