[發(fā)明專(zhuān)利]人PON1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510615081.0
• 申請(qǐng)日: 2015-09-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105331682A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉素香;李磊;李海娟;李露;宋新魁;李曉輝;張育紅;劉偉俊;歐海燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州市職業(yè)病防治院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京迎碩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11512
• 代理人: 張群峰;呂良

1.一種測(cè)定人PON1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)性的方法，包括：

提供待測(cè)人基因組DNA；

提供擴(kuò)增人PON1基因rs854560位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有錯(cuò)配堿基C；

以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以獲得含CCXTGG片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中X(T或A)為人PON1基因rs854560位點(diǎn)上待定堿基W(A或T)的互補(bǔ)堿基；

提供限制性?xún)?nèi)切酶；

利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以及

根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來(lái)確定人PON1基因rs854560位點(diǎn)上的待定堿基W是A還是T，

其中，限制性?xún)?nèi)切酶為僅能夠切開(kāi)CCATGG片段與CCTTGG片段之一的限制性?xún)?nèi)切酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯(cuò)配堿基C與多態(tài)堿基W的互補(bǔ)堿基X之間相隔一個(gè)堿基C。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與多態(tài)堿基W的互補(bǔ)堿基X相鄰。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中限制性?xún)?nèi)切酶為僅能切開(kāi)CCATGG片段的NcoI或其同裂酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類(lèi)型：具有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類(lèi)型來(lái)確定人PON1基因rs854560位點(diǎn)上的待定堿基W是A還是T。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類(lèi)型是通過(guò)凝膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來(lái)進(jìn)行的。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D像位置，其中第一參照?qǐng)D像位置針對(duì)的是未切斷的總片段長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D像位置則針對(duì)的是切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長(zhǎng)度而使得擴(kuò)增產(chǎn)物的總片段長(zhǎng)度在100bp至300bp之間，并且上游引物的片段長(zhǎng)度至少為35bp，使得酶切切掉部分片段占總片段的長(zhǎng)度的百分比超過(guò)20％。

9.一種用于測(cè)定人PON1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，其包含：

用于PCR擴(kuò)增人PON1基因rs854560位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有錯(cuò)配堿基C以獲得含CCXTGG片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中X(T或A)為人PON1基因rs854560位點(diǎn)上待定堿基W(A或T)的互補(bǔ)堿基；以及

僅能夠切開(kāi)CCATGG片段與CCTTGG片段之一的限制性?xún)?nèi)切酶。