[發明專利]用于鑒定雙孢蘑菇非雜交菌株特性的RAPD引物與方法

在審

• 申請號: 201510614429.4
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105112547A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 陳美元;廖劍華;李洪榮;郭仲杰;蔡志欣;盧政輝;王澤生
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體涉及用于鑒定雙孢蘑菇非雜交菌株特性的RAPD引物與方法。

背景技術

雙孢蘑菇是世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，具有重要的經濟價值，2014年的世界總產量達400多萬噸，約占世界食用菌總產量的四分之一。我國是世界上最大的雙孢蘑菇科研、生產、加工與出口的國家，2014年全國產雙孢蘑菇鮮品達200多萬噸，占世界年產量的一半，產值超百億元人民幣，因此雙孢蘑菇生產具有顯著的經濟效益、社會效益和生態效益。

我國1925年前后從國外引進雙孢蘑菇到國內栽培,1978年開始品種的改良。1989年本單位利用引進種質在國內首先育成雙孢蘑菇雜交菌株As2796并成為我國唯一的當家品種，目前已是世界上年產鮮菇量最大的雙孢蘑菇商業菌株。但是，As2796從育種至今已使用二十年，面臨著商業菌株不可避免的退化問題，而日漸細化發展的蘑菇產業也需要各類專用的優良新菌株。比如，高產型菌株適于工廠化生產，優質型蘑菇適于罐頭加工和鮮銷，等等。引入未經雜交的傳統或野生種質進行種質創新，進而通過分子標記輔助雜交育種等手段獲得各種優良專用雙孢蘑菇新菌株是解決此問題的重要途徑之一。

福建省農業科學院食用菌研究所（本發明人單位）多年來堅持收集世界各地的雙孢蘑菇種質資源，至今已保藏雙孢蘑菇菌株400多株，大部分為未經雜交的傳統或野生菌株，其中不乏高產菌株和優質菌株，如何快速評價和利用這些傳統或野生種質成為新品種選育的關鍵。這些傳統或野生菌株一般具有高產菌株不優質，而優質菌株不高產的特點，在雜交育種中需要選擇不同類型的親本，傳統的篩選手段盲目性強，需要進行出菇來篩選，工作量巨大。

近年來發展的DNA分子標記輔助育種技術是食用菌定向輔助育種的一個重要方向。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增的多態性DNA)技術在生命科學的許多研究領域已得到廣泛的應用，包括遺傳多態性研究、分類研究、遺傳關系分析、某些特定基因標記、作連鎖圖譜等。這種以PCR反應為基礎的技術克服了同工酶和RFLP等技術的一些缺點，具有快速、安全、簡便、靈敏度高、需樣量少的特點。我們通過大量的RAPD引物篩選和驗證，找到了一種適用于雙孢蘑菇非雜交菌株優質或高產性狀預測的、操作快速準確的分子標記。該標記與雙孢蘑菇菌株優質性狀緊密連鎖，利用該分子標記能在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定用作親本的傳統或野生菌株的優質或高產性狀，不用出菇試驗，省時省力，這對雜交育種中縮短育種周期、提高育種效率有著重要的意義。

發明內容

本發明基于分子標記技術，建立一種雙孢蘑菇非雜交菌株特性鑒定的RAPD標記與方法。

本發明為一種雙孢蘑菇非雜交菌株特性鑒定的RAPD標記與方法，是利用RAPD分子標記對雙孢蘑菇菌株進行PCR擴增。

利用RAPD引物對雙孢蘑菇菌株基因組DNA進行RAPD-PCR，能特異性地擴增出1900bp的產物，所述RAPD引物的核苷酸序列為：5’-GAGGTCCACA-3’。

所述的RAPD-PCR擴增條件為：94℃預變性2min；94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，擴增42個循環；72℃延伸5min,4℃保存。反應體系為：30ng模板DNA，30ng引物，0.1mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl₂，1UTaqDNA聚合酶，1×PCR緩沖液，用ddH₂O將總體積補至20μL。

本發明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇非雜交菌株的優質或高產特性，該方法耗時短，操作簡便，特異性強，無需出菇，省時省力。根據特異性擴增產物1900bp條帶的有無來鑒定菌株的優質或高產性狀，具有該條帶的菌株為優質菌株，沒有該條帶的菌株為高產菌株。

附圖說明

圖148個雙孢蘑菇非雜交菌株的RAPD-PCR擴增產物圖譜，M:LambdaDNA/EcoRI+HindIII分子量標記；1-24：24個優質菌株，25-48：24個高產菌株，詳見表1。箭頭指示1900bp特異條帶的位置，優質菌株均擴增出該條帶，高產菌株均未擴增出該條帶。

具體實施方式：

實施例1：

1.TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs購自廈門泰京生物有限公司，RAPD引物購自上海生工生物科技有限公司。所述RAPD引物的核苷酸序列為：5’-GAGGTCCACA-3’。