[發明專利]基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物及制備方法與應用

有效

• 申請號: 201510611772.3
• 申請日: 2015-09-23
• 公開（公告）號: CN105154070B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 邢達;張濤;吳云霞
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D405/14;C07D405/04;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于核酸標記領域，特別涉及一種基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物及制備方法與應用。

背景技術

核酸是一類由核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的成分。目前，核酸修飾技術是醫學和生物學領域中的常用研究工具，且已經被廣泛地用，核酸分子的修飾在分子識別的基礎研究、生物醫學診斷和DNA納米結構構建起重要作用。

早期傳統的DNA修飾方法是直接在DNA上修飾熒光分子，此方法對技術和設備要求較高操作復雜，純化手段復雜，不利于大規模推廣。近些年生物正交反應備受關注，尤其是應用于核酸和蛋白質的修飾。生物正交反應具有操作簡單，反應物易于合成、特異性高等優點，其在分子識別和醫學診斷領域應用廣泛。

近期基于點擊化學的生物正交反應備受關注，尤其是利用點擊反應對蛋白和核酸的修飾。點擊化學是一種疊氮化合物和炔烴的環化加成反應，它是2001年，由諾貝爾化學獎獲得者Sharpless報道出來的。它有反應速度快、反應條件較溫和、產率高、副產物少和立體選擇性高等特點，因此該方法自提出以來在化學、生物醫藥、分子識別、高分子合成等領域都有廣泛應用。

目前常用的基于點擊化學反應的DNA標記方法有：銅離子催化的疊氮化合物和炔烴的環化加成反應(CuAAC)，此方法微量的銅離子就能催化該反應的發生，反應速度快，但是有報道過渡態金屬催化劑銅(I)可以誘導病毒或寡核苷酸的降解，并且銅(I)作為催化劑具有細胞毒素，因此不適合在生物體內的應用。此外還有非銅催化的疊氮化合物和炔烴的環化加成反應，此反應速度慢，反應時間長，降低了該方法的推廣及普及性。

近幾年基于光點擊的生物正交反應被廣泛報道，如基于光點擊反應實現對蛋白質的修飾，是一種光控的且有熒光響應的蛋白質修飾方法。該方法是具有實時光控的生物正交反應，具有光誘導實時可控，非金屬催化，無毒，反應速度快，產率高、操作方便簡單，應用性廣等優點。

有文獻報道了一種基于光點擊反應的DNA修飾方法，該方法首次將光點擊反應應用于核酸修飾中，利用LED燈就可以實現核酸的標記，操作方便簡單，反應速度快等優點。但是該方法只實現了DNA的修飾，反應后沒有熒光響應，不具備多方面的應用。因此開發一種基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物在實際應用中仍具有重要意義。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物，該標記物具有實時光控的，具有光誘導實時可控、具有熒光響應、應用性廣等優點。

本發明的另一目的在于提供上DNA標記物的制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述DNA標記物的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物，為化合物W-3和W-4中的至少一種；所述的W-3和W-4結構式如式Ⅰ和Ⅱ所示：

所述的基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將四唑化合物W-1(Methyl4-(2-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)-2H-tetrazol-5-yl)benzoate)與氫氧化鋰在四氫呋喃甲醇和水的混合液中加熱攪拌反應，反應終止后調節溶液的pH值至出現紫色沉淀；得到中間體W-2；

(2)將步驟(1)制得的W-2與NHS(N-羥基丁二酰亞胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中攪拌反應以活化W-2；反應終止后，加入飽和食鹽水至沉淀析出，得到化合物W-3，即為具有熒光響應的DNA標記物基于光點擊反應且具有熒光響應的DNA標記物；

(3)將乙胺加入二氯甲烷中，然后再加入步驟(2)制得的W-3攪拌反應，減壓蒸餾，得到W-4；

步驟(1)中所述的W-1與氫氧化鋰的摩爾比優選為1:(15～20)；

步驟(1)中所述的W-1與氫氧化鋰的摩爾比進一步優選為1:20；

步驟(1)中所述的甲醇、四氫呋喃和水的混合液中，甲醇、四氫呋喃和水的體積比優選為1：(2～3)：1；

步驟(1)中所述的甲醇、四氫呋喃和水的混合液中，甲醇、四氫呋喃和水的體積比進一步優選為1:2:1；

步驟(1)中所述的加熱攪拌反應的溫度優選為45℃～55℃；

步驟(1)中所述的加熱攪拌反應的溫度進一步優選為50℃；