[發明專利]髓核-軟骨細胞外基質支架及其制備方法在審

申請號：	201510606522.0	申請日：	2015-09-21
公開（公告）號：	CN105031734A	公開（公告）日：	2015-11-11
發明（設計）人：	徐寶山;楊強;袁秋明;馬信龍;張楊;許海委	申請（專利權）人：	天津市天津醫院
主分類號：	A61L27/38	分類號：	A61L27/38;A61L27/36;A61L27/56
代理公司：	天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103	代理人：	董光仁
地址：	300211 ***	國省代碼：	天津;12
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摘要：
搜索關鍵詞：	髓核軟骨細胞基質支架及其制備方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物組織工程技術，具體是一種髓核-軟骨細胞外基質支架及其制備方法。

背景技術

隨著人口老齡化和人們工作、生活方式的改變，椎間盤退行性疾病越來越多，尤其是椎間盤突出等導致的頸肩痛、腰腿痛十分常見，病情嚴重者常需手術治療，椎間盤部分切除是脊柱外科最常采用的手術方法，然而椎間盤切除后一直沒有理想的修復重建方法。隨著組織工程技術的飛速發展，椎間盤組織工程為手術后椎間盤缺損的永久性修復帶來了可能。

近年來，用于構建組織工程椎間盤的支架材料研究較多。如取向性PCL支架，雖然結構規則、孔隙均勻，但成分與天然椎間盤相差很大，生物相容性差；聚已酸內酯蘋果酸三醇/脫鈣骨基質明膠雙相纖維環支架，雙相支架的內外層結合不牢、容易脫落，且生物相容性差；絲素蛋白支架雖然生物相容性較好，但成分差別很大且降解速率過慢。所以，目前國內外無論是天然仿生材料還是人工合成材料都難以達到理想的效果。

脫細胞基質去除了細胞和可溶性蛋白等引起免疫反應的物質，保留了組織的天然成分，具有良好的生物相容性，能夠為組織細胞生存提供相近的生存環境，脫細胞基質作為一種理想的支架載體，已得到廣泛的應用研究，其中豬脫細胞心瓣膜、豬脫細胞膀胱、異體脫細胞真皮基質已被批準應用于臨床。

完整脫細胞髓核基質支架也有相關報道，但髓核呈膠凍狀易散開，不易獲得完整的脫細胞髓核支架，而且該脫細胞髓核支架力學性能和可塑性差，種子細胞不易均勻分布到支架內，不能滿足椎間盤部分缺損的修復要求。來源于結締組織細胞外基質的明膠海綿已經上市并應用于臨床椎間盤退變修復的研究，但明膠海綿力學性能不足，成分和椎間盤細胞外基質相比也有較大差別。軟骨組織與髓核組織的細胞外基質的主要成分都是Ⅱ型膠原和蛋白多糖，兩者的細胞在形態和功能上也十分接近，均分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖，有學者（伍耀宏,徐寶山,楊強,等.以骨基質明膠及軟骨基質構建一體化纖維環-髓核雙相支架的實驗研究[J].中華骨科雜志,2013,33(2):179-185.）以脫細胞軟骨基質為髓核相制備了一體化纖維環-髓核雙相支架。另有學者在一項“纖維環與髓核一體化雙向支架及其構建方法”的專利（申請號：201310000722.2）中，將脫細胞髓核基質作為髓核相制備新型一體化纖維環-髓核雙相支架，但該脫細胞髓核基質制備方法存在脫細胞不易徹底，脫細胞周期長易變質，獲得的髓核細胞外基質懸液不易儲存、濃度不易調節的不足。而且一體化纖維環-髓核雙相支架適用于全椎間盤置換修復，而臨床上多椎間盤部分缺損。目前尚沒有將脫細胞髓核基質和脫細胞軟骨基質相混合制備支架的報道。

發明內容

本發明就是為了解決現有支架所存在的上述問題，而提供一種髓核-軟骨細胞外基質支架及其制備方法。

一種髓核-軟骨細胞外基質支架，所述支架是由凍干的脫細胞髓核基質與凍干的軟骨細胞外基質按照1:10~10:1的比例混合溶解，凍干后通過物理、或化學或物理與化學聯合的方式交聯而成的三維多孔海綿狀結構。

一種髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，包括以下步驟：

①脫細胞髓核基質的制備

a.將椎間盤髓核組織在0~4℃下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl緩沖液中振蕩8h~48h；

b.粉碎，采用密度梯度離心法獲取直徑為100nm-5μm的髓核基質微絲；

c.放入含0.5~2%TritonX-100和0.35~1.0%脫氧膽酸鈉的Tris-HCl緩沖液，0~4℃下振蕩12～72h；

d.無菌超純水清洗，用含有DNaseⅠ和RNaseA的無菌PBS緩沖液振蕩消化8～48h；

e.無菌超純水清洗，獲得脫細胞髓核基質微絲懸液，凍干，冷藏備用；

②脫細胞軟骨基質的制備

a.取骨關節面軟骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的無菌PBS緩沖液中;