[發明專利]髓核-軟骨細胞外基質支架及其制備方法

在審

• 申請號: 201510606522.0
• 申請日: 2015-09-21
• 公開（公告）號: CN105031734A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 徐寶山;楊強;袁秋明;馬信龍;張楊;許海委
• 申請（專利權）人: 天津市天津醫院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;A61L27/56
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

1.一種髓核-軟骨細胞外基質支架，其特征在于：所述支架是由凍干的脫細胞髓核基質與凍干的軟骨細胞外基質按照1:10~10:1的比例混合溶解，凍干后通過物理、或化學或物理與化學聯合的方式交聯而成的三維多孔海綿狀結構。

2.一種權利要求1所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

①脫細胞髓核基質的制備

a.將椎間盤髓核組織在0~4℃下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl緩沖液中振蕩8~48h；

b.粉碎，采用密度梯度離心法獲取直徑為100nm-5μm的髓核基質微絲；

c.將髓核基質微絲放入含0.5~2%TritonX-100和0.35~1.0%脫氧膽酸鈉的Tris-HCl緩沖液，0~4℃下振蕩12～72h；

d.無菌超純水清洗，用含有DNaseⅠ和RNaseA的無菌PBS緩沖液37℃下振蕩消化8～48h；

e.無菌超純水清洗，獲得脫細胞髓核基質微絲懸液，凍干，冷藏備用；

②脫細胞軟骨基質的制備

a.取骨關節面軟骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的無菌PBS緩沖液中振蕩8h~48h;

b.粉碎，密度梯度離心獲取直徑為100nm-5μm左右的軟骨基質微絲；

c.將軟骨基質微絲放入含蛋白酶抑制物和0.5~2%TritonX-100的Tris-HCl緩沖液中，0~4℃下振蕩12～72h；

d.無菌超純水清洗，用含DNaseⅠ和RNaseA的無菌PBS緩沖液37℃振蕩消化8～48h；

e.無菌超純水清洗，獲得脫細胞軟骨基質微絲懸液，凍干，冷藏備用；

③支架的構架和交聯

a．按質量比為凍干的脫細胞髓核基質：脫細胞軟骨基質=1:10~10:1的比例稱取以上兩種物質并溶于去離子水中，配成質量體積比為0.6%~6%的乳懸液；

b．將上述乳懸液注入模具中，排出模具中的氣體；

c．放入-20~-80℃冷凍1~48h；再放入冷凍干燥機中，待其完全凍干；

d.將凍干的樣品在碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中交聯1h～48h；或將凍干的樣品在京尼平溶液中交聯1h~48h；或將凍干的樣品在醛類化合物溶液中交聯1h～48h；或將凍干的樣品置于紫外線下交聯；或將凍干的樣品先經紫外線照射后采用化學試劑聯合交聯；

e．獲得的樣品進行清洗，烘干，滅菌。

3.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：所述步驟①a、c、d和步驟②c、d中振蕩頻率為80~250r/min。

4.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：所述步驟①a中Tris-HCl的濃度為50mmol/L，pH7.5；步驟①a和②a、c中蛋白酶抑制物為苯甲基磺酰氟，濃度為0.020~0.050mmol/L。

5.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：步驟①d和②d中DNaseⅠ和RNaseA的濃度分別為0.72~50U/ml、0.72~1U/ml。

6.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：步驟③d中碳化二亞胺的濃度為0.001～1m/L，N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為0.001～1m/L。

7.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：步驟③d中京尼平溶液的濃度為1%~2%。

8.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：步驟③d中醛類化合物溶液的濃度為0.01%～2.5%。

9.根據權利要求2所述的髓核-軟骨細胞外基質支架的制備方法，其特征在于：步驟③d中紫外線波長為258nm，距離光源5～10cm，交聯時間15min～8h。