[發明專利]一種利用真菌發酵制備漆酶的方法

在審

• 申請號: 201510589399.6
• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105062984A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 楊民和;巫婷玉;張婉蓉
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 謝名海

技術領域

本發明涉及一種利用真菌發酵制備漆酶的方法。

技術背景

漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)屬于多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO),是一類含銅的氧化還原酶,是在細菌、真菌、植物和哺乳動物體內都廣泛存在的一類銅蛋白,并具有廣泛的作用底物。多酚氧化酶能有效地催化多酚類化合物氧化形成相應的醌類物質，在含酚廢水處理、木質素降解以及染料脫色等領域得到較好的研究和應用。新鮮茶葉細胞中富含多酚氧化酶，能促使兒茶素類物質氧化形成茶黃素、茶紅素和其他氧化聚合物等，產生香氣化合物，是形成紅茶風味和特質的生化基礎。因此，多酚氧化酶在茶樹生理代謝及茶葉加工等過程中均發揮著重要的作用。

茶是三大無酒精飲料之一。大量研究發現飲用茶水除具有益思少睡、助消化、明目利尿等功效外，還有預防心血管病、糖尿病和抗癌等作用。隨著茶產業的發展，特別是速溶茶和液態茶飲料的生產，僅僅依靠傳統茶葉生產工藝已滿足不了生產的需要。高附加值茶產品生產技術，特別是酶工程技術將逐漸應用于茶葉加工中。目前，已有單寧酶、纖維素酶、多酚氧化酶和蛋白酶等酶制劑應用于茶葉加工。

本發明的特征在于利用茶葉(或茶水)作為主要的培養基成分,通過真菌發酵生產一種漆酶,該漆酶對茶水成分有一定的生物轉化作用,有望應用于茶葉深加工生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用真菌發酵制備漆酶的方法。將菌株接種于培養基中,發酵培養后獲得含有漆酶的發酵液,將該發酵液經過分離純化即獲得漆酶。

為實現本發明的目的而采用技術方案如下：

1、以終體積為1L的發酵培養基水溶液計，其各組份的配方為:

2、具體制備步驟:

(1)在每個250mL三角瓶中裝入上述發酵培養基，裝液量為60mL,按常規方法滅菌。

(2)在每個三角瓶中接入冠突散囊菌孢子懸浮液2mL，在溫度26～28℃,轉速120r/min的條件下搖瓶培養3～4天后,取發酵液經紗布過濾、離心獲得上清液即為粗酶液。

所述的冠突散囊菌孢子懸浮液，其濃度為1～2×10⁸個孢子/mL。

(3)粗酶液依次經過硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析和葡聚糖G-150凝膠層析，即得到分離純化的漆酶。

所述的硫酸銨分級沉淀，是指將制備好的粗酶液置于冰水浴中，緩慢加入研磨好的硫酸銨至飽和度50％，靜置2h，10000r/min，4℃離心10min，取上清液；在上清液中繼續加硫酸銨至飽和度80％，靜置12～18h，10000r/min，4℃離心10min，收集沉淀；用適量的pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，然后置于透析袋中，在pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液于4℃條件下透析脫鹽，更換緩沖液2-3次，透析結束后，測定酶活力和蛋白質含量，凍干濃縮。

所述的DEAE-纖維素陰離子交換柱層析，是指先將干粉的纖維素浸泡在蒸餾水中，充分溶脹后，去除雜質，用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2h，用超純水洗凈至pH中性，再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2h，用超純水水洗至中性后，再用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡，進行裝柱，壓實后靜置12～15h；把柱子與層析儀連接起來，流速為0.8mL/min，先用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡凝膠一段時間，直到基線平穩，將硫酸銨沉淀凍干濃縮后的酶液進行上樣，用1～1.5mol/LNaCl、pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液進行洗脫，用10mL的管收集，每管收集4mL，檢測各管的酶活，透析脫鹽，凍干濃縮，得到凍干的酶粉末，并于-20℃保存備用。

所述的葡聚糖G-150凝膠層析，是指將凍干的酶粉末，用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，10000r/min，4℃離心10min，取上清液待用；取適量的葡聚糖G-150粉末，加入超純水中，沸水浴溶脹5～6h，除去凝膠上層水及細小顆粒，用超純水反復洗滌2～3次，再以pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗滌2-3次，進行裝柱，壓實后過夜，把柱子與層析儀連接起來，流速為0.4mL/min，先用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡凝膠一段時間，直到基線平衡，取樣品上樣，緩沖液洗脫，用10mL的管收集，每管收集4mL，得到漆酶，檢測各管漆酶的酶活，凍干濃縮，-20℃保存。