[發明專利]一種利用真菌發酵制備漆酶的方法

在審

• 申請號: 201510589399.6
• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105062984A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 楊民和;巫婷玉;張婉蓉
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 謝名海

1.一種利用真菌發酵制備漆酶的方法，其特征在于

1）以終體積為1L的發酵培養基水溶液計，其各組份為：

麩皮30.0～35.0g

茶葉6～10g

蛋白胨2.5～4g

KH₂PO₄2.0～3.0g

MgSO₄·7H₂O0.2～0.5g

MnSO₄·5H₂O0.45～0.55g

CuSO₄·5H₂O0.01～0.02g

2）具體制備步驟:

(1)按以上發酵培養基配方配制培養基,在每個250mL三角瓶中裝入發酵培養基，液量為60mL,按常規方法滅菌；

(2)在每個三角瓶中接入冠突散囊菌孢子懸浮液2mL，溫度26～28℃,轉速120r/min的條件下搖瓶培養3～4天后,取發酵液經紗布過濾、離心獲得上清液即為粗酶液；

(3)粗酶液依次經過硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析和葡聚糖G-150凝膠層析，即得到分離純化的漆酶。

2.根據權利要求1所述的一種利用真菌發酵制備漆酶的方法，其特征在于所述的硫酸銨分級沉淀，是指將制備好的粗酶液置于冰水浴中，緩慢加入研磨好的硫酸銨至飽和度50%，靜置2h，10000r/min，4℃離心10min，取上清液；在上清液中繼續加硫酸銨至飽和度80%，靜置12～18h，10000r/min，4℃離心10min，收集沉淀；用適量的pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，然后置于透析袋中，在pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液于4℃條件下透析脫鹽，更換緩沖液2-3次，透析結束后，測定酶活力和蛋白質含量，凍干濃縮。

3.根據權利要求1所述的一種利用真菌發酵制備漆酶的方法，其特征在于所述的DEAE-纖維素陰離子交換柱層析，是指先將干粉的纖維素浸泡在蒸餾水中，充分溶脹后，去除雜質，用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2h，用超純水洗凈至pH中性，再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2h，用超純水水洗至中性后，再用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡，進行裝柱，壓實后靜置12～15h；把柱子與層析儀連接起來，流速為0.8mL/min，先用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡凝膠一段時間，直到基線平穩，將硫酸銨沉淀凍干濃縮后的酶液進行上樣，用1～1.5mol/LNaCl、pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液進行洗脫，用10mL的管收集，每管收集4mL，檢測各管的酶活，透析脫鹽，凍干濃縮，得到凍干的酶粉末，并于-20℃保存備用。

4.根據權利要求1所述的一種利用真菌發酵制備漆酶的方法，其特征在于所述的葡聚糖G-150凝膠層析，是指將凍干的酶粉末，用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，10000r/min，4℃離心10min，取上清液待用；取適量的葡聚糖G-150粉末，加入超純水中，沸水浴溶脹5～6h，除去凝膠上層水及細小顆粒，用超純水反復洗滌2～3次，再以pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗滌2-3次，進行裝柱，壓實后過夜，把柱子與層析儀連接起來，流速為0.4mL/min，先用pH6.0、0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡凝膠一段時間，直到基線平衡，取樣品上樣，緩沖液洗脫，用10mL的管收集，每管收集4mL，得到漆酶，檢測各管漆酶的酶活，凍干濃縮，-20℃保存。

5.根據權利要求1所述的一種利用真菌發酵制備漆酶的方法，其特征在于所述的冠突散囊菌孢子懸浮液，其濃度為1～2×10⁸個孢子/mL，配制過程如下：將冠突散囊菌的菌株接種到新鮮PDA培養基的平板上，在溫度28℃條件下培養5d后得到成熟孢子,用無菌蒸餾水洗下孢子，放入裝有無菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩，待孢子充分打散后，測孢子懸浮液OD600的值，并用無菌生理鹽水調整其OD值至2.0，即得孢子懸浮液。