[發明專利]一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法

有效

• 申請號: 201510588993.3
• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105255986B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 黨軍;王啟蘭;陶燕鐸;邵赟;梅麗娟;張莉;崔玉磊
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 馬麗娜

本發明公開了一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法，發明工藝簡單、回收率高、重復性較好、質量穩定可控，而且發明以細胞生長曲線為基本指標判定標準化組分和樣品對貼壁、繁殖等細胞生理活性的影響，結果直觀、易判斷；所得到的黃綠蜜環菌子實體抗肝癌甾醇類活性樣品(第Fr8?1號樣品和第Fr8?4號樣品)經NMR氫譜、碳譜分析，分別判定為3β?hydroxy?(22E,24R)?ergosta?5,8,22?trien?7?one和(3α,5α),(8β,11β)?diepidioxy?ergost?22E?en?12?one。

技術領域

本發明涉及藥物化學及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法及其應用。

背景技術

肝癌細胞(hepatocellular carcinoma,HCC,以下簡稱肝癌)是一種惡性程度高、預后兇險的腫瘤，5年生存率只有7％左右，是全球第五位最常見的惡性腫瘤，在全世界腫瘤患者的致死率中高居第三位。我國肝癌發病人數約占全球的半數以上，發病年齡趨于年輕化。目前我國肝癌年死亡率為20/10萬左右，位居我國各種惡性腫瘤死亡率的第2位，并且近10年來一直呈上升趨勢。肝癌已經成為嚴重威脅我國人民健康和生命的一大殺手，其危險性不容忽視。

研究表明，一些中藥復方或單味藥的有效成分能誘導腫瘤細胞凋亡，其抗癌療效與中藥誘導腫瘤細胞凋亡有關。黃綠蜜環菌子實體是生長于青藏高原的珍稀野生食藥用菌。目前有限的研究表明，黃綠蜜環菌子實體中含有較豐富的蛋白質、氨基酸、糖類、生物堿和少量有機酸、黃酮、強心苷、甾體三萜類、苷類、皂苷、揮發油、香豆素萜類、鞣質、酚類化合物等，該類化合物具有抗流感、防治神經炎、腳氣病、促進兒童發育、抗氧化及抗腫瘤等生物活性。

中國專利申請CN 103494843A《黃蘑菇標準化組分制法及其在肺癌治療中的應用》和CN 103494843A涉及了黃綠蜜環菌子實體標準化組分的制備方法及其在肺癌和肝癌中的應用，并未明確組分中的具體化學成分。文獻中對黃綠蜜環菌子實體化學成分的研究同樣極度匱乏。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、易于實施的一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類組分的制備方法。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供該黃綠蜜環菌甾醇類活性化合物在肝癌治療中的應用。

為解決上述問題，本發明所述的一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法，包括以下步驟：

⑴黃綠蜜環菌丙酮提取物加入其體積的1～6倍10％～50％正己烷-乙酸乙酯混合液進行溶解，溶解后過0.45μm的有機濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以10μm硅膠為分離基質的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr10、Fr12、、Fr13、Fr14共14個標準化組分樣品；

⑵將所述14個標準化組分樣品采用iCelligence實時無標記細胞分析儀按下述步驟進行體外抗肝癌細胞模型篩選：

①確認iCelligence測試系統正確連接，37℃、5％CO₂培養箱工作正常；

②8孔細胞板內按150μL/孔加入培養基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測試臺上測基線；所述培養基是指含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基；

③將所述14個標準化組分樣品中的每個組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；