[發明專利]一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法

有效

• 申請號: 201510588993.3
• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105255986B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 黨軍;王啟蘭;陶燕鐸;邵赟;梅麗娟;張莉;崔玉磊
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 馬麗娜

1.一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

⑴黃綠蜜環菌丙酮提取物加入其體積的1～6倍10％～50％正己烷-乙酸乙酯混合液進行溶解，溶解后過0.45μm的有機濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以10μm硅膠為分離基質的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr10、Fr12、、Fr13、Fr14共14個標準化組分樣品，所述14個組分樣品的分離參見圖1所示的制備色譜圖；

⑵將所述14個標準化組分樣品采用iCelligence實時無標記細胞分析儀按下述步驟進行體外抗肝癌細胞模型篩選：

①確認iCelligence測試系統正確連接，37℃、5％CO₂培養箱工作正常；

②8孔細胞板內按150μL/孔加入培養基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測試臺上測基線；所述培養基是指含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基；

③將所述14個標準化組分樣品中的每個組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；

④將對數生長期的人肝癌細胞HepG2，用胰酶按常規方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細胞重懸于所述培養基中，并將細胞濃度調至2.85×10⁴個/mL，得到對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液，并按345μL/孔、每孔10000個細胞的量將所述對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液接種入所述8孔細胞板的相應孔中，室溫放置30min；

⑤將所述14個標準化組分樣品分兩批按每孔加5μL所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345μL所述對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液的量接種入所述8孔細胞板的相應孔中，并置于所述iCelligence測試臺，放入所述培養箱中開始檢測；45h后得到兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖；其中縱坐標為細胞指數，橫坐標為實時細胞增殖動態效應；

⑥根據所述兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖，當細胞增殖曲線呈現上升平緩或不上升的趨勢，則說明細胞分裂減緩或停止，即細胞不能進行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號標準化組分具有體外抑制人肝癌細胞貼壁及增殖活性。

⑶將第8號標準化組分加入其體積的2～5倍5％～20％正己烷-乙醇混合液進行溶解，溶解后過0.45μm的有機濾膜，得到含第8號標準化組分的樣品溶液；所述含第8號標準化組分的樣品溶液在以10μm XAmide為分離基質的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Fr8-1、Fr8-2、Fr8-3、Fr8-4共4個樣品，所述4個樣品的分離參見圖3所示的制備色譜圖；

⑷將所述4個樣品采用iCelligence實時無標記細胞分析儀按下述步驟進行體外抗肝癌細胞模型篩選：

①確認iCelligence測試系統正確連接，37℃、5％CO₂培養箱工作正常；

②8孔細胞板內按150μL/孔加入培養基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測試臺上測基線；所述培養基是指含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基；

③將所述4個樣品中的每個樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；

④將對數生長期的人肝癌細胞HepG2，用胰酶按常規方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細胞重懸于所述培養基中，并將細胞濃度調至2.85×10⁴個/mL，得到對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液，并按345μL/孔、每孔10000個細胞的量將所述對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液接種入所述8孔細胞板的相應孔中，室溫放置30min；

⑤將所述4個樣品分兩批按每孔加5μL所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345μL所述對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液的量接種入所述8孔細胞板的相應孔中，并置于所述iCelligence測試臺，放入所述培養箱中開始檢測；45h后得到兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖；其中縱坐標為細胞指數，橫坐標為實時細胞增殖動態效應；

⑥根據所述兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖，當細胞增殖曲線呈現上升平緩或不上升的趨勢，則說明細胞分裂減緩或停止，即細胞不能進行正常的分裂，從而確定第Fr8-1號樣品和第Fr8-4號樣品具有體外抑制人肝癌細胞貼壁及增殖活性；

其中，所述步驟⑴和所述步驟⑶中減壓濃縮的條件是指真空度為0.06～0.09MPa，溫度為50～70℃；所述步驟⑴中制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260×50mm；采用A為正己烷、B為乙酸乙酯的二元流動相體系進行分離：0～15min，100％A～100％A；15～35min，60％A～60％A；35～50min，0％A～0％A；檢測波長為260nm；上樣量為1.0g；所述步驟(3)中制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為250×20mm；采用A為正己烷、B為乙醇的二元流動相體系進行分離：0～40min，97％A～92％A；檢測波長為260nm；上樣量為0.15或0.3g。