[發明專利]一種溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法

在審

• 申請號: 201510583400.4
• 申請日: 2015-09-15
• 公開（公告）號: CN105112373A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 卓凡清;馬健穎
• 申請（專利權）人: 上海麥禾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述分離方法包括以下步驟：

1)取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，低速離心，溶液分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去；

2)往離心管中加入濃度為3％的明膠生理鹽水溶液，對沉淀細胞進行重懸；

3)將重懸的細胞溶液自然沉淀60-70min，收集離心管中的明膠懸液層，并離心棄去上層清液；

4)往離心管中加入無血清培養基再次重懸細胞；

5)將重懸的細胞懸液加在淋巴細胞分離液的液面上，離心并將離心管中層白霧狀細胞層轉移到新的離心管中；

6)對白霧狀細胞層進行離心，除上清，再加入PBS溶液，重懸洗滌，重復兩次，加入無血清AIM-V培養基配置成懸液。

2.根據權利要求1所述的溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟1)具體為：取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，20℃，200×g離心10-20min，溶液分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去。

3.根據權利要求1所述的溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟2)中，加入的明膠生理鹽水溶液和中間液面層的總體積與離心管底部沉淀層的體積比例為2-2.5:1。

4.根據權利要求1所述的溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟3)中，先在20℃下，將重懸的細胞溶液自然沉淀60-70min，收集離心管中的明膠懸液層，然后將明膠懸液層在200×g的離心力下離心10min，棄去上層清液。

5.根據權利要求1所述的溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟5)具體為：另一離心管中預先裝入淋巴分離液，再將重懸的細胞懸液加在淋巴細胞分離液的液面上，重懸的細胞懸液和淋巴細胞分離液體積比為1-2：1，然后400×g離心30～40min，用吸管吸取離心管中的中層白霧狀細胞層轉移到新的離心管中。

6.根據權利要求1所述的溶血性貧血患者外周血單核細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟6)具體為：所述白霧狀細胞層450×g離心10min后去除上層清液，再加入PBS溶液，重懸洗滌，重復兩次，加入無血清AIM-V培養基配置成懸液。